一种提高左旋多巴产生菌生产能力的方法

本发明属于生物，具体涉及到生产左旋多巴的基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、左旋多巴(l-dopa)又名3-羟基-l-酪氨酸，是一种在医药卫生、保健美容等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。自1908年以后世界各国广泛应用于临床，目前是治疗震颤麻痹最有效的药物。左旋多巴(如美多芭)治疗常见老年病帕金森氏病己有40多年的历史，至今仍是治疗帕金森病最有效的药物，且耐受性好，不但能改善运动迟缓，缓解主要症状，而且能延长帕金森病患者的寿命。据统计，普通人群帕金森病的发病率为0.1％，60岁以上老人的发病率为1％，80岁以上的发病率为2％。随着人口老龄化速度的加快，对左旋多巴的需求将迅速增加。左旋多巴2007年在世界畅销药中排名100。

2、目前，左旋多巴的制备方法主要有化学合成、生物酶催化以及生物发酵。工业化化学合成生产左旋多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经过8步的反应制得。尽管目前商品化左旋多巴主要通过不对称法合成，但化学合成过程中需要大量的金属催化物，并且过程繁杂，产物的转化效率和旋光活性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。生物酶转化法主要以l-酪氨酸或酚类物质为底物，通过来源于微生物的酶体外制取左旋多巴。目前已报道2种酶可以催化多巴的生成。酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol lyase，tpl)(ec4.1.99.2)可催化邻苯二酚、丙酮酸和氨水生成左旋多巴，催化反应过程中需要磷酸吡哆醛(胺)为辅酶、钾离子和氨离子为辅因子。该催化体系还存在一些缺点，反应时间长、转化效率不高、分离成本高、原料比较昂贵。生物酶法由于需要相对昂贵的原料，生产成本还是偏高，难以适应工业化生产应用。

3、生物发酵法就以低成本的葡萄糖等为原料，通过微生物菌种发酵生产左旋多巴。2016年中山大学发表文章中发酵72h左旋多巴达到8.5g/l(wei t,cheng by,liujz.genome engi neering escherichia coli for l-dopa overproduction fromglucose.sci rep.2016,6:30080.)。2019年江南大学发表文章中发酵48h左旋多巴达到25.53g/l(eric fordjour,frederick komla adipah,shenghuzhou,guocheng du,andjingwen zhou.metabolic engineering of escherichi a coli bl21(de3)for de novoproduction of l-dopa from d-glucose.microb cell fact.2019；18:74.)。

技术实现思路

1、本发明的目的是构建左旋多巴产量更高的基因工程菌株，利用基因工程技术来改造大肠杆菌(例如以cn201711003046.9中公开的大肠杆菌t004为出发菌株)获得更高产量左旋多巴的大肠杆菌。通过易错pcr的方法对酪氨酸羟化酶亚基hpab进行筛选，获得能够提高左旋多巴发酵产量的突变体。在大肠杆菌t004中，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，在苯乙醛脱氢酶基因(feab)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflb)、乳酸脱氢酶(ldha)、乙醇脱氢酶(adhe)处整合突变的酪氨酸羟化酶(hpab*)，得到不同的工程菌株。

2、本发明提供酪氨酸羟化酶突变体(hpab*)，其参考seq id no:1所示氨基酸序列基础上存在r113y或y117a或c123m或t292a或r379g中一个或两个或三个或四个五个的突变点组合。

3、本发明还提供所述的酪氨酸羟化酶突变体在制备左旋多巴中的应用。

4、本发明提供一种能够发酵生产左旋多巴的重组大肠杆菌(escherichia coli)，其在出发大肠杆菌中，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，在苯乙醛脱氢酶基因(feab)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflb)、乳酸脱氢酶(ldha)、乙醇脱氢酶(adhe)处整合如权利要求1所述的酪氨酸羟化酶突变体(hpab*)而得到的工程菌株。

5、优选地，所述出发大肠杆菌是具有左旋多巴的能力的大肠杆菌，具体地，所述出发大肠杆菌是大肠杆菌t0004。

6、更优选地，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，用酪氨酸羟化酶突变基因hpab*(t292a)整合到基因组中苯乙醛脱氢酶基因(feab)位点；用酪氨酸羟化酶突变基因hpab*(r113y和r379g)整合到基因组中丙酮酸甲酸裂解酶(pflb)位点；用酪氨酸羟化酶突变基因hpab*(y117a和c123m)整合到基因组中乳酸脱氢酶(ldha)位点；或者用酪氨酸羟化酶突变基因hpab*(t292a和r379g)整合到基因组中乙醇脱氢酶(adhe)位点，通过筛选获得左旋多巴产量进一步提高的重组大肠杆菌。

7、本发明提供一种发酵生产左旋多巴的方法，其包括以下步骤：用所述的重组大肠杆菌发酵，以葡萄糖为底物生产左旋多巴。

8、具体地，所述发酵的温度为25℃-42℃，具体为25℃或30℃或37℃或40℃或42℃；所述发酵的体系的ph值为6.0-8.0，具体为6.0或7.0或8.0；

9、所述发酵的时间为24-96小时，具体为24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或84小时或96小时；

10、所述发酵的接种量的体积百分比0.05％-15％，具体为0.05％或2％或5％或10％或15％；

11、在具体实施方式中，所述发酵的培养基成分包括：

12、大量元素：葡萄糖、酵母提取物、柠檬酸、kh2po4、(nh4)2so4、mgso4·7h2o；

13、微量元素：feso4·7h2o、mnso4·h2o、na2so4、znso4、cocl2·6h2o、cuso4·5h2o；

14、优选地，所述成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：

15、大量元素：起始葡萄糖20g/l-50g/l或20g/l或30g/l或40g/l或50g/l，在发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/l以下时，开始用浓度为500g/l-600g/l的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/l、酵母提取物0-2g/l、柠檬酸1g/l-5g/l、kh2po42.5g/l-10g/l、(nh4)2so40.8g/l-2.4g/l、mgso4·7h2o 1g/l-4g/l；

16、微量元素：feso4·7h2o 50mg/l-100mg/l、mnso4·h2o 2.5mg/l-7.5mg/l、na2so410mg/l-50mg/l、znso42mg/l-10mg/l、cocl2·6h2o 1mg/l-6mg/l、cuso4·5h2o0.2mg/l-1mg/l。

17、进一步地，所述成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：

18、酵母提取物0g/l或0.5g/l或1g/l或2g/l、柠檬酸1g/l或2g/l或3g/l或5g/l、kh2po42.5g/l或5g/l或7.5g/l或10g/l、(nh4)2so4 0.8g/l或1.2g/l或1.6g/l或2.0g/l或2.4g/l、mgso4·7h2o1g/l或2g/l或3g/l或4g/l；

19、微量元素：feso4·7h2o 50mg/l或75mg/l或100mg/l、mnso4·h2o 2.5mg/l或5mg/l或7.5mg/l、na2so410mg/l或20mg/l或30mg/l或40mg/l或50mg/l、znso4 2mg/l或4mg/l或6mg/l或8mg/l或10mg/l、cocl2·6h2o 1mg/l或2mg/l或4mg/l或6mg/l、cuso4·5h2o 0.2mg/l或0.4mg/l或0.6mg/l或0.8mg/l或1mg/l。

20、本发明所构建的融合不同位点时的，大肠杆菌在摇瓶培养利用无机盐培养基，37℃发酵不超过72小时，得到的发酵液中左旋多巴的产量较出发菌分别提高12％、15％、25％、22％，其具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.酪氨酸羟化酶突变体，其特征在于，其参考seq id no:1所示氨基酸序列基础上存在r113y或y117a或c123m或t292a或r379g中一个或两个或三个或四个五个的突变点组合。

2.如权利要求1所述的酪氨酸羟化酶突变体在制备左旋多巴中的应用。

3.一种能够发酵生产左旋多巴的重组大肠杆菌（escherichia coli），其特征在于，在出发大肠杆菌中，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，在苯乙醛脱氢酶基因feab、丙酮酸甲酸裂解酶pflb、乳酸脱氢酶ldha或乙醇脱氢酶adhe处整合如权利要求1所述的酪氨酸羟化酶突变体hpab*而得到的工程菌株。

4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发大肠杆菌是具有左旋多巴的能力的大肠杆菌，具体地，所述出发大肠杆菌是大肠杆菌t0004。

5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，用含t292a突变的酪氨酸羟化酶突变体hpab*的基因整合到基因组中苯乙醛脱氢酶基因feab位点；用含r113y和r379g突变的酪氨酸羟化酶突变体hpab*的基因整合到基因组中丙酮酸甲酸裂解酶pflb位点；用含y117a和c123m突变的酪氨酸羟化酶突变体hpab*的基因整合到基因组中乳酸脱氢酶（ldha）位点；或者用含t292a和r379g突变的酪氨酸羟化酶突变体hpab*基因整合到基因组中乙醇脱氢酶adhe位点，获得左旋多巴产量进一步提高的重组大肠杆菌。

6.一种发酵生产左旋多巴的方法，其特征在于，包括以下步骤：用如权利要求3至5任一项所述的重组大肠杆菌发酵，以葡萄糖为底物生产左旋多巴。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25℃-42℃，具体为25℃或30℃或37℃或40℃或42℃；所述发酵的体系的ph值为6.0-8.0，具体为ph6.0或7.0或8.0。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为24-96小时，具体为24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或84小时或96小时；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：

技术总结
本发明公开生产左旋多巴的基因工程菌及其应用。本发明的目的是构建左旋多巴产量更高的基因工程菌株，通过易错PCR的方法对酪氨酸羟化酶亚基hpaB进行筛选，获得能够提高左旋多巴发酵产量的突变体。然后在大肠杆菌中，通过同源重组介导的基因无痕插入与替换方法，在苯乙醛脱氢酶基因（feaB）、丙酮酸甲酸裂解酶（pflB）、乳酸脱氢酶（ldhA）、乙醇脱氢酶（adhE）处整合突变的酪氨酸羟化酶（hpaB*），得到不同的工程菌株。尤其获得了左旋多巴生产能力有较大幅度提高的重组大肠杆菌，具有工业化发酵生产左旋多巴的应用前景。

技术研发人员：王钦宏,陈五九,禹卫东,宋国田,谢华丽,吴凤礼,陈燕娜,彭彦峰,张媛媛
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23