一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法与流程
本发明涉及一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，属于化学分析。
背景技术：
1、阿普斯特是一种pde4抑制药，对环单磷酸腺苷(camp)有特异性。pde4在camp的水解过程中起重要作用，对pde4的抑制作用导致细胞内camp水平增加，从而可抑制免疫和炎症反应。用于斑块型银屑病治疗的pde4抑制剂，用于适合光疗和系统疗法的中度至重度斑块型银屑病(plaque psoriasis)成人患者的治疗。阿普司特化合物专利cn100427085c于2023年3月到期，晶型专利已经无效。
2、阿普司特s-异构体具有良好的药代动力学性质，对雌性大鼠的口服生物利用度f＝64％，半衰期t1/2＝5h，且具有中等程度的分布容积和低清除率，对多种cyp氧化酶无抑制作用，血浆蛋白结合率90％。大鼠体内药效学实验表明具有较高的抗炎活性：用脂多糖诱导tnf-α生成的抑制作用ed50＝0.03mg·kg-1；脂多糖诱导嗜中性细胞的抑制作用ed50＝0.3mg·kg-1。而r-阿普斯特为其异构体杂质，几乎无药效。因此其对映体的检测和分离对药物的品质产生至关重要的影响。
3、手性柱是分离手和鉴定性药物的重要方法之一。手性柱液相色谱是一种广泛应用于商业生产的手性分离技术，这种技术被广泛应用于制药，环境，农业和食品行业，手性柱液相色谱可以高效地分离混合物中的手性分子，并评估药物或食品中不同手性形式的含量。在这种方法中，使用手性固相材料作为固体相分离混合的手性化合物，手性柱的选择性是由手性制剂和手性固定相之间的相互作用确定的，分子复杂性越高，手性选择性就越高。cn105628841a公布了一种使用直链淀粉-三(3-氯苯基氨基甲酸酯)的硅胶色谱填料来分离鉴定阿普斯特对应体的方法。该方法用甲基叔丁基醚-乙醇-二乙胺作为流动相。cn104792913a使用了直链淀粉类手性柱进行阿普斯特测定。然后淀粉由于颗粒强度，稳定性等问题，一直难以实用化。迫切需要开发新的色谱填料去检测分离阿普斯特。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种有很好的系统适用性与专属性、准确度、线性、耐用性及精密度，用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法。
2、本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，采用高效液相色谱法对阿普斯特对映异构进行检测，采用手性色谱柱，所述色谱柱的填料为l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖的结构如下：
3、
4、优选的，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖是将l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯在碱性条件下，打开环氧基团链接到葡聚糖上，热聚合反应得。
5、优选的，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖的制备原料中，l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯、葡聚糖、碱的质量比为[1～5]:[20～50]:[0.01～0.1]，聚合反应的温度为20～60℃，热聚合反应的时间为1～24h。
6、优选的，所述碱是采用质量百分比浓度为0.1％的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液中的一种。
7、优选的，所述色谱柱采用150mm×2.1mm，3μm thermo acclaim c30色谱柱，色谱柱填料颗粒直径为5μm，采用稀释剂按梯度洗脱的方式，稀释剂为流动相a和流动相b按比例混合；所述流动相a为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠溶于水中；所述流动相b为乙腈
8、优选的，所述检测器是vwd/dad检测器。
9、优选的，所述流速为0.8～1.2ml/min；所述进样体积为10ul。
10、优选的，所述检测波长为238～250nm。
11、优选的，所述柱温为35～45℃。
12、优选的，所述流动相a为8.2g磷酸氢二钠与0.56g磷酸二氢钠溶于1l水中；所述流动相b为浓度为100％的乙腈；所述流动相a和流动相b进行梯度洗脱的初始比例为90:10～70:30；所述流动相a和流动相b进行梯度洗脱的终点比例为90:10～70:30。
13、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
14、本发明的用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，在特定的色谱条件下，空白峰和杂质峰对阿普斯特对映异构体含量测定不干扰，重复性试验s-阿普斯特rsd为0.4％(n＝6)。本发明的阿普斯特对映异构体含量方法操作简便，节约检测时间，降低检测成本。本发明通过阿普斯特样品标准品和阿普斯特供试品制成的加标样品溶液进行多项验证验证，专属性强，线性、准确度高，耐用性好，可用于药品日常检测的需要，并且本发明的测定方法，稳定性好，重复性高，分离度高，检测限低，灵敏度高，且对仪器无损伤。
技术特征：
1.一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法对阿普斯特对映异构进行检测，采用手性色谱柱，所述色谱柱的填料为l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖的结构如下：
2.根据权利要求1所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖是将l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯在碱性条件下，打开环氧基团链接到葡聚糖上，热聚合反应制得。
3.根据权利要求2所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，所述l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯葡聚糖的制备原料中，l-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯、葡聚糖、碱的质量比为[1～5]:[20～50]:[0.01～0.1]，聚合反应的温度为20～60℃，热聚合反应的时间为1～24h。
4.根据权利要求3所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，所述碱是采用质量百分比浓度为0.1％的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液中的一种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用150mm×2.1mm，3μm thermo acclaim c30色谱柱，色谱柱填料颗粒直径为5μm，采用稀释剂按梯度洗脱的方式，稀释剂为流动相a和流动相b按比例混合；所述流动相a为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠溶于水中；所述流动相b为乙腈。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，检测器是vwd/dad检测器。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，流速为0.8～1.2ml/min；所述进样体积为10ul。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，检测波长为238～250nm。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，柱温为35～45℃。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，其特征在于，所述流动相a为8.2g磷酸氢二钠与0.56g磷酸二氢钠溶于1l水中；所述流动相b为浓度为100％的乙腈；所述流动相a和流动相b进行梯度洗脱的初始比例为90:10～70:30；所述流动相a和流动相b进行梯度洗脱的终点比例为90:10～70:30。
技术总结
本发明公开了一种用液相色谱分离测定阿普斯特对映异构体的检测方法，采用高效液相色谱法进样，对阿普斯特R‑和S‑对映体进行分离检测，使用Thermo Acclaim C30型号的毛细管色谱柱，其内径为2.1mm，长度为150mm，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为35～5℃，紫外检测波长为230～250nm，采用稀释剂按梯度洗脱的方式，稀释剂为流动相A和流动相B按比例混合；所述流动相A为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠溶于水中，所述流动相B为乙腈。本发明的检测方法简便，节约时间，降低成本，有很好的系统适用性与专属性、准确度、线性、耐用性及精密度，用于检测阿普斯特对映异构含量是适宜的、准确的，从而可用于日常阿普斯特药物检测的需要。
技术研发人员：李明,杨明明,陈海霞,吴杰,褚路露,张旭东,林仁涛,沈小芳
受保护的技术使用者：浙江皓格药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23