一种去除重组胶原蛋白中残留DNA的方法

本发明属于纯化技术，具体涉及一种去除重组胶原蛋白中残留dna的方法。

背景技术：

1、生物合成已经成为蛋白类制品的主要生产方式，然而来源于生产基质的宿主残留dna为产品使用带来风险。宿主残留dna是指可能出现于重组生物制剂中的来自宿主细胞或者细菌胞质中的dna片段，这些dna尽管有着相同的基本结构单位，但其片段长度不同，以不同的物理形式存在，可能对生物制剂的安全性造成包括感染性、致瘤性以及免疫原性。因此，各个国家对其在产品中的残留dna的标准进行了控制，《中国药典(2020版)》规定，细胞基质生产的生物制剂残留dna不得超过100pg/剂，细菌或真菌基质生产的疫苗残留dna不得超过10ng/剂。

2、重组胶原蛋白是一类线性蛋白质，在高密度发酵中，重组胶原蛋白的浓度较高，线状的重组胶原蛋白分子往往和同样是线状的宿主残留dna分子以氢键、静电相互作用、范德华力等作用形成复杂密集的网络结构，因此，在重组胶原蛋白的生产中，宿主残留dna的分离是极困难的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，该方法可有效实现重组胶原蛋白的快速有效纯化，纯化后宿主残留dna分子含量远低于国家药典规定的宿主残留dna标准。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，包括：

3、步骤一、将发酵液用冲洗后中空纤维柱进行过滤，得到蛋白母液；

4、步骤二、进行离子交换层析，具体包括：将所述蛋白母液稀释后经平衡液洗杂、洗涤液洗杂和洗脱液洗脱，完成离子交换层析；

5、步骤三、利用超滤设备进行超滤除盐，其中超滤浓缩时进口压力为0.02～0.08mpa，回流压力为0.01～0.03mpa。

6、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤一具体包括：

7、步骤101、将中空纤维柱用纯化水冲洗，至回流端流出液和过滤端流出液ph均为中性；

8、步骤102、用冲洗后中空纤维柱对发酵液进行过滤，得到蛋白母液；

9、步骤103、按照步骤101用纯化水对步骤102过滤后中空纤维柱进行冲洗；

10、步骤104、用亚硫酸氢钠溶液对步骤103纯化水冲洗后中空纤维柱进行冲洗。

11、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤104中，所述亚硫酸氢钠溶液的体积为填料体积的3～5倍。

12、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，稀释后所述蛋白母液中，蛋白含量为2～6mg/ml，ph为5±0.1～7.0±0.1，电导率为3.0-3.5ms/cm。

13、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述平衡液为浓度为20mm的pbs缓冲液，所述平衡液的ph为5±0.1～7.0±0.1；所述平衡液的体积为填料体积的5～8倍。

14、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述洗涤液为质量比为(7～8):(2～3)的平衡液和pbs氯化钠溶液的混合液，所述pbs氯化钠溶液为将氯化钠加入到浓度为20mm的pbs缓冲液中得到的pbs氯化钠溶液，所述pbs氯化钠溶液中氯化钠的浓度为1m，ph为5±0.1～7.0±0.1；洗涤液洗杂所用洗涤液的体积为填料体积的10～15倍。

15、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，洗脱液洗脱压力为0.1～0.3mpa。

16、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述洗脱液为质量比为(95～98):(2～5)的所述平衡液和所述pbs氯化钠溶液的混合液，所述洗脱液的体积为填料体积的5～8倍。

17、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤二将所述蛋白母液稀释后经平衡液洗杂之前还包括：用碱液对中空纤维柱进行平衡、用注射用水置换碱液和用平衡液冲洗以实现再平衡。

18、上述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤三进行超滤浓缩包括：将物料进行超滤浓缩至滤液电导率突变将物料进行超滤浓缩至滤液电导率突变；所述突变为滤液电导率≤20μs/cm或滤液电导率瞬时值超过35μs/cm。

19、本发明与现有技术相比具有以下优点：

20、1.本发明去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，可有效实现重组胶原蛋白的快速有效纯化，纯化后宿主残留dna分子含量远低于国家药典规定的宿主残留dna标准。

21、2.本发明去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，可通过先将重组胶原蛋白构象调控后进行残留dna的去除，随后再将重组胶原蛋白构象还原为初始，相较于传统的去除残留dna的方式，分离去除效率更高。

22、3.本发明去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，包括通过洗杂和洗脱实现构象调控和还原，可有效避免传统蛋白质构象转换方法，比如通过醛类物质转换、紫外照射或超声等方式所带来的新的杂质以及改变原本蛋白质构象的缺陷。

23、4.本发明去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，可有效去除重组胶原蛋白分子和dna分子之间因氢键、静电相互作用和范德华力等结合在一起形成的密集网络，实现残留dna分子的有效脱除。

24、下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

25、说明书附图

26、图1为本发明去除重组胶原蛋白中残留dna的方法原理示意图。

27、图2为本发明去除重组胶原蛋白中残留dna流程示意图。

28、图3为残留dna去除前后重组胶原蛋白的电镜图。

技术特征：

1.一种去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤一具体包括：

3.根据权利要求2所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤104中，所述亚硫酸氢钠溶液的体积为填料体积的3～5倍。

4.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，稀释后所述蛋白母液中，蛋白含量为2～6mg/ml，ph为5±0.1～7.0±0.1，电导率为3.0-3.5ms/cm。

5.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述平衡液为浓度为20mm的pbs缓冲液，所述平衡液的ph为5±0.1～7.0±0.1；所述平衡液的体积为填料体积的5～8倍。

6.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述洗涤液为质量比为(7～8):(2～3)的平衡液和pbs氯化钠溶液的混合液，所述pbs氯化钠溶液为将氯化钠加入到浓度为20mm的pbs缓冲液中得到的pbs氯化钠溶液，所述pbs氯化钠溶液中氯化钠的浓度为1m，ph为5±0.1～7.0±0.1；洗涤液洗杂所用洗涤液的体积为填料体积的10～15倍。

7.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，洗脱液洗脱压力为0.1～0.3mpa。

8.根据权利要求6所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，所述洗脱液为质量比为(95～98):(2～5)的所述平衡液和所述pbs氯化钠溶液的混合液，所述洗脱液的体积为填料体积的5～8倍。

9.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤二将所述蛋白母液稀释后经平衡液洗杂之前还包括：用碱液对中空纤维柱进行平衡、用注射用水置换碱液和用平衡液冲洗以实现再平衡。

10.根据权利要求1所述的去除重组胶原蛋白中残留dna的方法，其特征在于，步骤三进行超滤浓缩包括：将物料进行超滤浓缩至滤液电导率突变；所述突变为滤液电导率≤20μs/cm或滤液电导率瞬时值超过35μs/cm。

技术总结
本发明公开了一种去除重组胶原蛋白中残留DNA的方法，包括：步骤一、将发酵液用冲洗后中空纤维柱进行过滤，得到蛋白母液；步骤二、进行离子交换层析，具体包括：将所述蛋白母液稀释后经平衡液洗杂、洗涤液洗杂和洗脱液洗脱后得到洗脱蛋白溶液，完成离子交换层析；步骤三、利用超滤设备进行超滤除盐。本发明可有效实现重组胶原蛋白的快速有效纯化，纯化后宿主残留DNA分子含量远低于国家药典规定的宿主残留DNA标准。

技术研发人员：范代娣,雷桓,米钰,马沛
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23