大黄鱼抗菌肽Hepcidin-like的制备方法与流程

本发明涉及抗菌肽，更具体的说是涉及大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法。

背景技术：

1、抗菌肽是生物防御系统产生的一类具有对抗外源性病原体活性的肽类物，具有广谱抑杀菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫、病毒和肿瘤细胞。因此，抗菌肽在医药、农业、畜牧业等多个领域都具有重要的潜在应用前景。

2、hepcidin是一类具有β-折叠结构的抗菌肽，2002年首次从杂交斑纹鲈鱼的鳃中分离获得了一个hepcidin的成熟肽片段，具有广谱抗菌活性。迄今，已从多种鱼类中分离克隆到h e p c i d i n基因，包括虹鳟鱼(o n c o rh y n c h us m y k i s s)、黑鲷(a ca n t h o p a g ru s s c h l e g e l ii b)、大西洋马哈鱼(sa l m o s a l a r)、大黄鱼(larimichthyscrocea)。鱼类hepcidin的研究，主要集中在与细菌感染和炎症相关的研究上，更关注其在先天性免疫系统中的作用。大黄鱼hepcidin为阳离子抗菌肽，由信号肽、前导肽和成熟肽组成，具有广谱抑杀菌活性，对nacl和mgcl2具有一定的耐受能力。黑鲷hepcidin-like参与了抗菌的免疫反应。

3、刺激隐核虫(cryptocaryon irritans)是能够感染绝大部分海水鱼类的体外寄生的原生动物，传播性极强，已被列为农业部二类动物疫病，他所引发的“海水白点病”和继发行细菌感染给海水鱼养殖带来了巨大的经济损失，其能导致大黄鱼75％的死亡率。因此由刺激隐核虫引起的海水白点病的防止是急亟需解决。化学类药物和抗生素的使用不仅造成养殖环境的污染，最重要的是抗生素的残留。利用鱼类的自身免疫系统来抵抗寄生虫的感染成为了研究热点，也是一种健康安全的防控方式。已有研究发现不少的抗菌肽具有很强的抗虫功能，大黄鱼piscidin-like既有广谱的抗菌活性，又是一种很强的抗虫肽；眼斑拟石首鱼sciaenopsocellatuspiscidin-like仅具有较强的抗虫活性[11]。从丰富的海洋动物抗虫活性物质资源库中筛选具有特殊杀虫效果的抗虫肽，进行抗虫相关产品开发或者提高鱼类自身抗虫水平，具有巨大的科学价值、市场需求和发展前景。

4、体外重组表达大黄鱼hepcidin-like不仅在研究大黄鱼抗刺激隐核虫的免疫防御机制方面具有重要意义，而且为研发抗病药物提供参考依据。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，旨在解决上述技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，包括如下步骤：

4、1)给出具有序列表中序列1的开放阅读框和系列表中序列2的氨基酸序列；

5、2)lc-hepl的orf克隆；

6、3)构建表达载体；

7、4)重组表达载体pet-32a-hepl在大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)plys中转化宿主细胞并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

8、5)分离纯化步骤4)得到的表达产物，得到重组蛋白lc-hepl。

9、进一步的，在步骤2)中，所述lc-hepl的orf克隆的方法为：利用健康大黄鱼鳃提取总rna并反转录为cdna模板，根据genebank公布lc-hepl的cdna序列设计带有限制性内酶切位点(ecori/xho i)引物，克隆获得lc-hepl的orf中除编码信号肽的序列。

10、进一步的，在步骤3)中，所述构建表达载体的具体方法为：将步骤2)中获得的带有酶切位点的lc-hepl的orf序列及pet-32a质粒进行ecori/xho i双酶切暴露粘性末端，使用t4连接酶进行连接，构建表达载体，重组质粒命名为pet-32a–lc-hepl。

11、进一步的，在步骤3)中，所述表达载体选用pet-32a。

12、进一步的，在步骤4)中，所述宿主细胞选用e.coli bl21(de3)plyss。

13、进一步的，在步骤5)中，先将步骤4)所得的表达产物进行亲和层析，再进行透析。

14、所述l c-h e p l对刺激隐核虫具有明显的抑杀活性，因此所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like在制备抗虫药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添加剂中应用。

15、所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like命名为lc-hepl。

16、所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like基因的编码序列为：

17、

18、所述大黄鱼抗菌肽heocidin-like的氨基酸序列为：

19、

20、本发明在分离得到lc-hepl的基础上，根据lc-hepl基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组lc-hepl蛋白，该重组蛋白具有一定的抗菌活性和较强的抗刺激隐核虫活性。研究结果表明，lc-hepl是一种重要的先天免疫因子，广泛参与了大黄鱼的抗病原生物感染反应，因此，重组基因工程产品lc-hepl在抗虫新药的开发中具有非常诱人的应用前景。

技术特征：

1.一种大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述lc-hepl的orf克隆的方法为：利用健康大黄鱼鳃提取总rna并反转录为cdna模板，根据genebank公布lc-hepl的cdna序列设计带有限制性内酶切位点(ecori/xho i)引物，克隆获得lc-hepl的orf中除编码信号肽的序列。

3.如权利要求2所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述构建表达载体的具体方法为：将步骤2)中获得的带有酶切位点的lc-hepl的orf序列及pet-32a质粒进行ecori/xho i双酶切暴露粘性末端，使用t4连接酶进行连接，构建表达载体，重组质粒命名为pet-32a–lc-hepl。

4.如权利要求3所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述表达载体选用pet-32a。

5.如权利要求3所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述宿主细胞选用e.coli bl21(de3)plyss。

6.如权利要求3所述大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的制备方法，其特征在于在步骤5)中，先将步骤4)所得的表达产物进行亲和层析，再进行透析。

技术总结
本发明公开了一种大黄鱼抗菌肽Hepcidin‑like的制备方法，并提供了大黄鱼抗菌肽Hepcidin‑like基因的编码序列以及氨基酸序列；给出具有序列表中序列1的开放阅读框和系列表中序列2的氨基酸序列；Lc‑HepL的ORF克隆；构建表达载体；重组表达载体pET‑32a‑HepL在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pLys中转化宿主细胞并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化得到的表达产物，得到重组蛋白Lc‑HepL；Lc‑HepL对刺激隐核虫具有抑杀活性，在制备抗虫药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添加剂中应用。

技术研发人员：郑利兵,陈佳
受保护的技术使用者：宁德泩泩渔业科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23