一种用于猴痘病毒分型检测的组合物、试剂盒及其应用

本技术涉及生物，尤其涉及一种用于猴痘病毒分型检测的组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、猴痘（monkeypox）是一种由猴痘病毒（monkeypox virus, mpxv）引起的以皮肤出疹为特征的人畜共患的罕见病毒性疾病，其临床症状类似于天花。猴痘病毒归类于痘病毒科正痘病毒属，是对人类致病的4种正痘病毒属之一。猴痘病毒主要通过动物传播，人类可以因为被病毒感染动物的咬伤或者直接接触被病毒感染动物的血液、体液和皮疹而感染猴痘，此外该病毒也可通过人与人的接触的方式进行传播。对于目前分离到的mpxv比较分析，可将mpxv分为分布于西非和刚果盆地的2个进化支。而针对这两个进化支目前已重新命名猴痘病毒分支，将刚果盆地分支称为分支i，将西非分支称为分支ii。然而这两个分支病毒感染引起的临床症状相似，但是刚果盆地分支（分支i）显示出更高的致病性和传播效率。在致死率方面分支ⅱ的致死率约为3.6%，而分支ⅰ的致死率高达10%。由于分支i和分支ii这两种进化支病毒引起疾病的流行病学和临床特征均不相同，对两个不同分支进行鉴别检测有助于监控猴痘病毒流行趋势的变化，并有助于针对不同的分支出现的风险做出防控措施。

2、病毒分离、血清学检验、分子生物学检验是现阶段诊断mpxv的常用方法。通常病毒分离鉴定法需要3天～6天，且存在生物安全危害的隐患，需要在三级生物安全实验室进行。虽然诊断猴痘病毒的方式也可以使用血清学诊断法，但是血清诊断法的灵敏度不高，不易鉴别并诊断天花、猴痘及其他出皮疹的疾病。虽然一代测序被誉为各代测序法的金标准，但是其检测通量较低，耗时长。然而二代测序的检测通量高，但是操作繁琐、耗时长。所以现阶段使用实时荧光定量pcr（real time fluorescence quantitative pcr，real time-pcr）技术进行病毒特异性的快速诊断分型，该real time-pcr技术具有特异性好、灵敏度高等特点，可以被广泛用于临床样本、环境样本以及食品样本中的微生物检测。但是由于mpxv的分支i和分支ii的差异较小，经过real time-pcr技术进行快速诊断分型时，难以有效地区分mpxv的分支i和分支ii。

技术实现思路

1、本技术提供了一种用于猴痘病毒分型检测的组合物、试剂盒及其应用，以解决如下技术问题：如何提高real time-pcr技术检测猴痘病毒的准确性。

2、第一方面，本技术提供了一种用于猴痘病毒分型检测的组合物，所述组合物包括一类组合物和二类组合物，所述一类组合物包括第一组合引物和/或第二组合引物，所述二类组合物包括第三组合引物和/或第四组合引物，所述一类组合物用于检测猴痘病毒分支i，所述二类组合物用于检测猴痘病毒分支ii；

3、在所述一类组合物包括第一组合引物的情况下，所述第一组合引物的上游引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述第一组合引物的下游引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；

4、在所述一类组合物包括第二组合引物的情况下，所述第二组合引物的上游引物具有如seq id no.3所示的核苷酸序列，所述第二组合引物的下游引物具有如seq id no.4所示的核苷酸序列；

5、在所述二类组合物包括第三组合引物的情况下，所述第三组合引物的上游引物具有如seq id no.5所示的核苷酸序列，所述第三组合引物的下游引物具有如seq id no.6所示的核苷酸序列；

6、在所述二类组合物包括第四组合引物的情况下，所述第四组合引物的上游引物具有如seq id no.7所示的核苷酸序列，所述第四组合引物的下游引物具有如seq id no.8所示的核苷酸序列。

7、可选的，在所述一类组合物包括第一组合引物的情况下，所述一类组合物还包括第一探针，所述第一探针具有如seq id no.9所示的核苷酸序列；

8、在所述一类组合物包括第二组合引物的情况下，所述一类组合物还包括第二探针，所述第二探针具有如seq id no.10所示的核苷酸序列；

9、在所述二类组合物包括第三组合引物的情况下，所述一类组合物还包括第三探针，所述第三探针具有如seq id no.11所示的核苷酸序列；

10、在所述二类组合物包括第四组合引物的情况下，所述一类组合物还包括第四探针，所述第四探针具有如seq id no.12所示的核苷酸序列。

11、可选的，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的一端具有报告荧光基团，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的另一端具有淬灭基团和/或小沟结合物。

12、可选的，所述报告荧光基团包括以下至少一种：

13、fam、vic、hex、rox、cy5、tet、tamra、joe、cy3和texas red。

14、可选的，在所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的另一端具有淬灭基团的情况下，所述淬灭基团包括以下至少一种：

15、bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq和lowa blacktm fq。

16、第二方面，本技术提供了一种制备第一方面所述的组合物的方法，所述方法包括：

17、将猴痘病毒分支i基因组和猴痘病毒分支ii基因组进行差异分析，确定目标基因区域；

18、将天花病毒基因组、牛痘病毒基因组和所述目标基因区域进行分析比对，后根据位点差异化的原则，分别设计用于检测猴痘病毒分支i基因组的一类组合物以及用于检测猴痘病毒分支ii基因组的二类组合物。

19、可选的，所述猴痘病毒分支i基因组的目标基因区域包括d14l基因，所述d14l基因位于所述猴痘病毒分支i基因组的第18880位～19206位；

20、所述猴痘病毒分支ii基因组目标基因区域包括d14l基因的两侧序列，所述d14l基因的两侧序列位于所述猴痘病毒分支ii基因组的第18865位～18989位。

21、第三方面，本技术提供了一种用于猴痘病毒分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的组合物。

22、可选的，所述试剂盒还包括猴痘病毒分支i的i型阳性对照质粒和猴痘病毒分支ii的ii型阳性对照质粒，所述i型阳性对照质粒具有如seq id no.13所示的核苷酸序列，所述ii型阳性对照质粒具有如seq id no.14所示的核苷酸序列。

23、第四方面，本技术提供一种用于猴痘病毒分型检测的组合物的应用，所述应用包括将第一方面所述的组合物作为猴痘病毒的分型检测试剂中。

24、本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

25、本技术实施例提供的一种用于猴痘病毒分型检测的组合物，所述组合物包括一类组合物和二类组合物，所述一类组合物包括第一组合引物和/或第二组合引物，所述二类组合物包括第三组合引物和/或第四组合引物，所述一类组合物用于检测猴痘病毒分支i，所述二类组合物用于检测猴痘病毒分支ii；在所述一类组合物包括第一组合引物的情况下，所述第一组合引物的上游引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述第一组合引物的下游引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；在所述一类组合物包括第二组合引物的情况下，所述第二组合引物的上游引物具有如seq id no.3所示的核苷酸序列，所述第二组合引物的下游引物具有如seq id no.4所示的核苷酸序列；在所述二类组合物包括第三组合引物的情况下，所述第三组合引物的上游引物具有如seq id no.5所示的核苷酸序列，所述第三组合引物的下游引物具有如seq id no.6所示的核苷酸序列；在所述二类组合物包括第四组合引物的情况下，所述第四组合引物的上游引物具有如seq id no.7所示的核苷酸序列，所述第四组合引物的下游引物具有如seq id no.8所示的核苷酸序列。该组合物针对d14l基因在猴痘病毒分支i和猴痘病毒分支ii的差异，同时针对天花病毒、牛痘病毒等痘病毒属中d14l基因的差异化位点进行特异性设计，可以得到针对猴痘病毒分支i的一类组合物，另外基于猴痘病毒分支ii缺失d14l基因位点的两侧序列进行特异性设计，可以得到针对猴痘病毒分支ii的二类组合物，通过一类组合物和二类组合物得到的组合物可以分别且有效的鉴别出猴痘病毒以及猴痘病毒的分型，从而可以提高rt-pcr技术检测猴痘病毒的准确性。

技术特征：

1.一种用于猴痘病毒分型检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括一类组合物和二类组合物，所述一类组合物包括第一组合引物和/或第二组合引物，所述二类组合物包括第三组合引物和/或第四组合引物，所述一类组合物用于检测猴痘病毒分支i，所述二类组合物用于检测猴痘病毒分支ii；

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，在所述一类组合物包括第一组合引物的情况下，所述一类组合物还包括第一探针，所述第一探针具有如seq id no.9所示的核苷酸序列；

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的一端具有报告荧光基团，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的另一端具有淬灭基团和/或小沟结合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述报告荧光基团包括以下至少一种：

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，在所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的另一端具有淬灭基团的情况下，所述淬灭基团包括以下至少一种：

6.一种制备如权利要求1～5任一项所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述猴痘病毒分支i基因组的目标基因区域包括d14l基因，所述d14l基因位于所述猴痘病毒分支i基因组的第18880位～19206位；

8.一种用于猴痘病毒分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～5任一项所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括猴痘病毒分支i的i型阳性对照质粒和猴痘病毒分支ii的ii型阳性对照质粒，所述i型阳性对照质粒具有如seqid no.13所示的核苷酸序列，所述ii型阳性对照质粒具有如seq id no.14所示的核苷酸序列。

10.一种用于猴痘病毒分型检测的组合物的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1～5任一项所述的组合物作为猴痘病毒的分型检测试剂中。

技术总结
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于猴痘病毒分型检测的组合物、试剂盒及其应用；所述组合物包括一类组合物和二类组合物，一类组合物包括具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列的第一组合引物和/或具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列的第二组合引物，二类组合物包括具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列的第三组合引物和/或具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列的第四组合引物。通过一类组合物和二类组合物得到的组合物可以分别快速且有效的鉴别出猴痘病毒以及猴痘病毒的分型，从而可以提高检测猴痘病毒的准确性。

技术研发人员：曹冉冉,杨小蓉,潘明,刘晨霞
受保护的技术使用者：四川省疾病预防控制中心（四川省预防医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23