一种目标双链DNA的合成方法与流程

本申请涉及dna合成，特别是一种目标双链dna的合成方法。

背景技术：

1、现有的dna合成技术主要基于化学合成方法，包括固相合成方法，如费戈森法（phosphoramidite method）。这类方法通过逐个添加核苷酸单体到固定在固相载体上的合成链上，实现dna序列的合成。

2、但是，现有技术在实际应用中存在如下问题：dna合成长度有限：通过化学合成方法可以有效地合成短到中等长度的单链dna（通常在20-100bp）但是在合成较长的dna片段（超过100bp）时效率下降，错误率上升（一般到达200bp左右时，保真度会降低到80%甚至更低）；重复序列的合成难度较大：含有高度重复序列的dna片段难以通过化学方法合成，因为这些重复序列容易导致合成过程中的滑移和错误（一般重复性的polya序列只能做到30-40bp，且大部分化学合成都无法合成多个相隔的重复区间，比如哺乳动物系统所长需要的polya 尾巴）；高gc含量序列的合成难度较大：高gc含量的dna片段也难以通过化学方法合成，因为gc富集区域的稳定性高，在合成过程中很容易自形成发卡，导致后续单碱基无法继续对接合成；效率低成本高：化学合成方法在合成长链或复杂dna片段时需要大量的纠错以及增大反应次数，造成效率较低且成本较高；存在环境污染风险：化学合成方法使用的试剂和溶剂（如丙酮、乙醇、异丙酮、三氯乙烯和氯仿等）对环境有潜在的负面影响。

技术实现思路

1、鉴于上述提到的问题，提出了本申请以便提供克服所述问题或者至少部分地解决所述问题的一种目标双链dna的合成方法，包括：

2、对一组碱基序列互补的单链组成片段进行退火处理，得到初级组成片段，其中，所述单链组成片段包括单链子片段和连接在所述单链子片段两端的限制性内切酶的识别片段；

3、对所述初级组成片段进行若干轮组装，直至符合第一长度要求，得到中级组成片段；

4、对所述中级组成片段进行若干轮扩增，直至符合第二长度要求，得到目标双链dna。

5、在本申请的实施例中，相对于现有方法合成长度有限、重复序列或高gc含量序列合成难度较大、效率较低、成本较高和存在环境污染风险的问题，本申请提供了将长链dna分解为较小片段并进行模块化组装的解决方案。通过将目标dna分解为中级组成片段并通过特定方法进行组装，提高了目标dna合成的成功率和准确性；通过特殊的设计和优化，可以更有效地合成包含重复序列的dna片段和高gc含量的dna片段；相较于传统方法，本申请在合成长链和复杂dna序列方面的效率较高且成本较低；此外，本申请属于酶法dna合成，可以减少有害化学物质的使用，降低对环境的负面影响。

技术特征：

1.一种目标双链dna的合成方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述目标双链dna中脱氧鸟嘌呤核苷酸和脱氧胞嘧啶核苷酸的含量大于等于70%，和/或，连续重复的碱基对数量大于等于50bp。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述目标双链dna的长度大于等于240bp。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述中级组成片段的长度大于等于120bp。

5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述单链组成片段的长度为60-90nt。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述单链子片段的长度为30nt。

7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述限制性内切酶为sfani、bsmfi或btgzi。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述载体为移除了bsai酶切位点和bsmbi酶切位点的pbelobac11载体。

9. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述特定引物的5’端含有arbitrarygc-rich序列。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法还包括：

技术总结
本申请提供了一种目标双链DNA的合成方法。包括：对目标双链DNA的中级组成片段进行若干轮扩增，直至符合目标双链DNA的长度要求，得到目标双链DNA；扩增步骤包括：采用特定引物对上一轮扩增完成的中级组成片段进行聚合酶链式反应扩增，得到特异双链DNA；其中，特定引物中含有限制性内切酶的识别片段；采用限制性内切酶在识别片段之外对特异双链DNA进行切割，得到至少一端形成粘性单链末端的粘性双链DNA；对粘性双链DNA进行退火处理，使粘性双链DNA通过粘性单链末端两两连接，得到当前轮扩增完成的中级组成片段。通过将目标DNA分解为中级组成片段并通过特定方法进行组装，提高了目标DNA合成的成功率和准确性。

技术研发人员：贺新蕊,陈萧宇
受保护的技术使用者：涌源合生科技（深圳）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23