一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物及其试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物及其试剂盒。

背景技术：

1、肝癌是发病率较高的一类恶性肿瘤，肝细胞癌为其主要的组织病理学类型。大多数肝癌患者有乙肝或肝硬化病史，但由于肝癌早期无明显症状且在高危人群中没有普及筛查意识，导致就诊时大多已为中晚期。早期肝癌患者5年生存率超过50%，而晚期肝癌患者5年生存率不足20%。因此早发现和早诊断治疗是提高肝癌患者生存率的一个关键因素。

2、目前，超声联合血清甲胎蛋（afp）检测是最广泛采用的肝癌筛查技术。根据实际临床和国内外报道，afp诊断肝癌的灵敏度为25%~65%，特异性为80%~94%，特别是在小肝癌和早期肝癌诊断中的假阴性较高。超声对肝癌的诊断灵敏度为84%，但对早期肝癌的灵敏度和特异性仅为63%和45%。

技术实现思路

1、基于外周血游离dna可以检测到肿瘤细胞的遗传学和表观遗传学改变（体细胞突变、拷贝数变异以及甲基化改变），而甲基化异常区分组织特异性要优于突变和拷贝数变异。本发明的目的在于提供一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，通过对肝癌、配对的癌旁以及肝病组织样本使用大面板捕获测序，该大面板覆盖的甲基化位点是传统的甲基化芯片的10倍，筛选出与肝癌相关的基因的甲基化变化位点30008个，组成一个大小约480k的捕获面板，使用该捕获面板对肝癌、肝病以及健康人血浆样本筛选出甲基化差异明显的三个甲基化区域，在组合后得到更高的灵敏度和特异性来区分肝癌、肝病以及健康人。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，所述标记物组合物是由3个标记物组合而成；

4、所述标记物组合物中的各标记物在参考基因组上的位置如下所示：

5、标记物1，位于chr17:30970348-30970741的整个区域或部分区域；

6、标记物2，位于chr2:63054088-63054326的整个区域或部分区域；

7、标记物3，位于chr6:26250469-26250942的整个区域或部分区域；

8、所述参考基因组为hg38基因组。

9、作为优选地，所述标记物1选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域1位于chr17:30970348-30970428；区域2位于chr17:30970452-30970550；区域3位于chr17:30970629-30970741。

10、作为优选地，所述标记物2选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域4位于chr2:63054088-63054212；区域5位于chr2:63054112-63054305；区域6位于chr2:63054194-63054326。

11、作为优选地，所述标记物3选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域7位于chr6:26250469-26250577；区域8位于chr6:26250563-26250692；区域9位于chr6:26250594-26250753；区域10位于chr6:26250594-26250753。

12、一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物在制备肝癌检测或辅助诊断产品中的应用。

13、作为优选地，所述检测产品为试剂、试剂盒、芯片、杂交探针和测序文库中的任意一种。

14、一种用于肝癌检测或辅助诊断的试剂盒，包含标记物组合物的引物探针组以及与标记物组合物的引物探针组中的任意一个序列的相似程度在90%及以上的序列。

15、作为优选地，所述标记物1甲基化检测的引物与探针包括用于检测区域1的引物探针组合1，用于检测区域2的引物探针组合2，用于检测区域3的引物探针组合3；

16、其中引物探针组合1如seq id no.1-3所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合2如seq id no.4-6所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合3如seq id no.7-9所示的上游引物序列，下游引物序列以及探针序列；

17、其中标记物2甲基化检测的引物与探针包括用于检测区域4的引物探针组合4，用于检测区域5的引物探针组合5，用于检测区域6的引物探针组合6；

18、其中引物探针组合4如seq id no.10-12所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合5如seq id no.13-15所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合6如seq id no.16-18所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列；

19、其中标记物3甲基化检测的引物与探针包括用于检测区域7的引物探针组合7，用于检测区域8的引物探针组合8，用于检测区域9的引物探针组合9，用于检测区域10的引物探针组合10；其中引物探针组合7如seq id no.19-21所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合8如seq id no.22-24所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合9如seq id no.25-27所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列，引物探针组合10如seq id no.28-30所示的上游引物序列、下游引物序列以及探针序列。

20、作为优选地，所述试剂盒还包括内参基因β-actin的pcr引物探针组合，如seq idno.31-33所示的上游引物序列，下游引物序列以及探针序列。

21、上述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、dna聚合酶以及pcr扩增缓冲液。

22、作为优选地，所述试剂盒的检测样本包括组织样本、血液样本或腹水样本；组织样本来自离体新鲜病理组织、石蜡包埋组织或肝癌细胞，血液样本来自离体血浆、离体血清、离体全血或离体血细胞。

23、上述探针序列的5’端均标记有荧光报告基团，探针序列的3’端均标记有荧光淬灭基团。

24、荧光报告基团为cy3、cy5、hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、texas red、ned、alexa flour、vic中的任意一种；淬灭基团为mgb、tamra、qsy、bhq1、bhq2、bhq3中的任意一种。

25、在其他实施方式中，也可以根据条件自行进行调整探针标记的荧光报告基团和猝灭基团，并不仅仅限定为以上表述的这几种类型。

26、另一方面，本发明还提供了肝癌检测试剂盒，不仅包含上述标记物和内参基因β-actin的引物探针组合，还包含阳性质控品和阴性质控品。

27、标记物1-3的阳性质控品为肝癌细胞系dna，阴性质控品为bj细胞系dna。

28、上述甲基化检测方式包括焦磷酸测序法、甲基化测序法、甲基化特异性微阵列法、甲基化特异性pcr法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化特异性高效液相层析法以及fen1内切酶法。

29、本发明中所述甲基化可以理解为甲基化水平、甲基化程度或甲基化状态，指的是在一段dna序列上的cpg二核苷酸中胞嘧啶上的第5位碳原子是否发生甲基化、发生甲基化在发生甲基化和未发生甲基化的总和的占比/频率/百分比，既可以是一个定性的概念，也可以是一个定量的概念。本领域技术人员可根据实际情况使用定性或定量的方法来确定甲基化。

30、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

31、（一）本发明使用的三个标记物以及组合是从甲基化位点覆盖范围高于传统的甲基化芯片10倍的杂交捕获面板中筛选而获得，在本发明所使用的样本集中，筛选的标记物以及组合的检测性能表现最优；

32、（二）本发明在组织与血浆筛选标记物以及组合的杂交捕获测序实验中均是使用酶转化的方法将胞嘧啶转化成尿嘧啶，相较于传统的亚硫酸氢盐转化，对dna的损伤更小，不会造成cfdna的断裂，从而保留cfdna的真实甲基化状态；

33、（三）本发明筛选的标记物组合的甲基化检测试剂盒，可以实现更高的灵敏度和特异性来区分肝癌、肝病以及健康人，具有简单、便捷、灵敏、无创、样本多样化的优势，可以作为肝癌的早期筛查，实时监测的重要辅助手段。

技术特征：

1.一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，其特征在于，所述标记物组合物是由3个标记物组合而成；

2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，其特征在于，所述标记物1选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域1位于chr17:30970348-30970428；区域2位于chr17:30970452-30970550；区域3位于chr17:30970629-30970741。

3.根据权利要求1所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，其特征在于，所述标记物2选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域4位于chr2:63054088-63054212；区域5位于chr2:63054112-63054305；区域6位于chr2:63054194-63054326。

4.根据权利要求1所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物，其特征在于，所述标记物3选自如下至少包含一个cpg位点的一种区域中的整个区域或部分区域：区域7位于chr6:26250469-26250577；区域8位于chr6:26250563-26250692；区域9位于chr6:26250594-26250753；区域10位于chr6:26250594-26250753。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物在制备肝癌检测或辅助诊断产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的一种应用，其特征在于，所述检测产品为试剂、试剂盒、芯片、杂交探针和测序文库中的任意一种。

7.一种用于肝癌检测或辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1中的标记物组合物的引物探针组以及与标记物组合物的引物探针组中的任意一个序列的相似程度在90%及以上的序列。

8.根据权利要求7所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述标记物1甲基化检测的引物与探针包括用于检测区域1的引物探针组合1，用于检测区域2的引物探针组合2，用于检测区域3的引物探针组合3；

9. 根据权利要求7所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因β-actin的pcr引物探针组合，如seq id no.31-33所示的上游引物序列，下游引物序列以及探针序列。

10.根据权利要求7所述的一种用于肝癌检测或辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本包括组织样本、血液样本或腹水样本；组织样本来自离体新鲜病理组织、石蜡包埋组织或肝癌细胞，血液样本来自离体血浆、离体血清、离体全血或离体血细胞。

技术总结
本发明公开了一种用于肝癌检测或辅助诊断的标记物组合物及其试剂盒。本发明使用的三个标记物以及组合是从甲基化位点覆盖范围高于传统的甲基化芯片10倍的杂交捕获面板中筛选而获得，在本发明所使用的样本集中，筛选的标记物以及组合的检测性能表现最优；筛选的标记物组合的甲基化检测试剂盒，可以实现更高的灵敏度和特异性来区分肝癌、肝病以及健康人，具有简单、便捷、灵敏、无创、样本多样化的优势，可以作为肝癌的早期筛查，对肝癌检测的灵敏度和特异性有很大的提升，对实现肝癌的早期筛查和诊断，实时监测更加有利。

技术研发人员：徐建锋,李典格,刘铁燕,张素芳,杨婷
受保护的技术使用者：北京莱盟君泰国际医疗技术开发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23