一种检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的crRNA及应用

本发明属于医学检测，具体涉及一种检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的crrna及应用。

背景技术：

1、毛滴虫是一类属于副基体门的寄生于无脊椎动物和脊椎动物口腔、消化系统和泌尿生殖系统的厌氧原生生物，其往往具有3~5个前鞭毛，1个氢化酶体，1个副基体和复杂的细胞骨架。已被报道的寄生于人或动物的毛滴虫虫种有阴道毛滴虫( trichomonas  vaginalis)、人五毛滴虫( pentatrichomonas hominis, p.hominis)、胎儿三毛滴虫( tritrichomonas foetus, t.foetus)和禽毛滴虫( trichomonas gallinae)；其中，人五毛滴虫是唯一一种人畜共患的毛滴虫。

2、人五毛滴虫与其他毛滴虫相似，仅有滋养体阶段；虫体生活史简单，滋养体既是其繁殖期亦是其感染期，主要经粪-口途径传播，也可直接在宿主间传染。当滋养体被宿主经口摄入后，主要寄生在宿主的大肠，通过胞吞、胞饮和内渗的方式从宿主肠内容物中获取营养。滋养体以二分裂的方式增殖，可随粪便排出体外，在适宜的外界环境中能存活数小时或数天，并保持感染性。胎儿三毛滴虫滋养体呈前端圆、后端尖的梨形，长10 μm~20 μm，具1个细胞核，鞭毛源于虫体前端的动基体，含3根游离前鞭毛和1根向体后延伸的后鞭毛。波动膜与后鞭毛伴行，沿体表从前向后延伸，呈3~5个波浪状回折，摆动时可使虫体呈现一种特征性的颤动，进而与其他原虫区分。人五毛滴虫的感染宿主众多，哺乳动物、爬行动物、鸟类中均发现这种寄生虫的身影。哺乳动物中比较常见的感染宿主有人、非人灵长类动物、犬、猪、猫等，其对感染宿主的危害主要表现为引发宿主的腹泻或加重原有的腹泻症状。人作为感染宿主时，儿童是易感人群，危害儿童身体健康；感染其他动物时，可能出现黏液性腹泻或出血性腹泻。胎儿三毛滴虫可感染牛、猫、犬、猪等，其寄生于牛生殖道和猫消化道时，可引起牛和猫的毛滴虫病。其中牛毛滴虫病主要经性途径传播，可引起牛阴道炎、子宫内膜炎、流产和不孕不育等症状；而猫毛滴虫病主要经粪口途径传播，可引起猫慢性腹泻或感染后无症状；犬、猪感染时，也多引起腹泻的症状。因此，建立一种快速、简便、准确、及时的人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫感染检测方法尤为重要。

3、目前，检测毛滴虫主要通过镜检法和pcr方法。镜检法虽然操作简单，成本低，但检测灵敏度较低，且操作人员需要具备一定的专业知识来辨认虫种。pcr方法包括常规pcr和荧光定量pcr，是公认的一种同时具备高灵敏度和特异性的检测方法，大大提高了检测结果的准确性。但该方法需要贵重的实验仪器，操作流程复杂，耗时长，成本较高，同时也需要具备相关的专业知识，无法在非实验环境的现场进行检测。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, rpa)是以t4噬菌体核酸复制机制为原理，通过重组酶蛋白(t4 uvs x)、单链结合蛋白(t4 gp32)和dna聚合酶(bsu)的作用，在体外完成核酸的恒温扩增反应。该技术对仪器设备要求低，仅需要恒温条件（37~42℃）即可完成反应，无需精密仪器。但是，基于该技术的检测方法存在假阳性的缺点。

4、现有技术已将crispr/cas12a开发成基因编辑工具，同时报道了crispr/cas12a的反式切割活性，即cas12a的双链dna切割活性一经激活之后，就可以极高的活性切割任意序列的单链dna。利用这一特性，crispr/cas12a随后被开发成核酸检测工具，但是crispr/cas12a自身检测灵敏度受限。

5、值得注意的是，crispr/cas检测系统与等温扩增技术结合实现了技术的完美互补，等温扩增技术可以提高crispr/cas检测的灵敏度，crispr/cas系统利用向导rna（以下简称为crrna）的特异性识别能力，可以提高检测特异性。目前crispr/cas检测系统与等温扩增技术结合已用于多种病原的检测。但是，目前未见基于crispr/cas检测系统和等温扩增技术建立灵敏、特异、无需昂贵设备和可视化检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的方法的报道。

技术实现思路

1、本发明提供一种检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的crrna及应用，旨在解决现有人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的检测方法耗时长、假阳性率高、需要昂贵仪器或专业技术人员、无法实现现场实时检测等技术问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明目的之一在于提供一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的crrna，所述crrna的序列如seq id no.19所示。

4、本发明目的之二在于提供一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂，所述试剂中含有上述crrna。

5、本发明目的之三在于提供上述crrna或上述试剂在制备检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂盒中的应用。

6、一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述crrna、cas12a蛋白、荧光基团和荧光猝灭基团双标记的dna探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。

7、进一步地，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别如seqid no.28和seq id no.38所示。

8、进一步地，所述dna探针为fam-ttatt-biotin。

9、本发明目的之四在于提供上述试剂盒在非疾病诊断目的可视化检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫中的应用。

10、本发明目的之五在于提供一种非疾病诊断目的可视化检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的方法，采用上述crrna进行检测，包括如下步骤：

11、s1、制备样本核酸模板；

12、s2、使s1所得核酸模板、cas12a蛋白、荧光基团和荧光猝灭基团双标记的dna探针，以及所述crrna在crispr-cas12a体系中反应；

13、s3、对s2反应体系进行荧光强度检测，肉眼直接判读样本是否感染人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫。

14、进一步地，s1所述样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增制备。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、1、本发明提供一种基于rpa-crispr-cas12a的对人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的检测工具，该工具包含侧流层析试纸条，能实现方便、快捷、肉眼可视化的结果判读。

17、2、本发明测试方法在等温条件下完成，无需专业的仪器设备，能够在野外环境进行快速、准确的检测，为基层监控和检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫感染提供了良好的技术手段。

18、3、crispr/cas检测系统与等温扩增技术结合使得本发明方法的敏感性和特异性良好，适合对犬猫临床样品的检测。

技术特征：

1.一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的crrna，其特征在于，所述crrna的序列如seq id no.19所示。

2.一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述crrna。

3.权利要求1所述的crrna或权利要求2所述的试剂在制备检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂盒中的应用。

4.一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述crrna、cas12a蛋白、荧光基团和荧光猝灭基团双标记的dna探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别如seq id no.28和seq id no.38所示。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述dna探针为fam-ttatt-biotin。

技术总结
本发明公开了一种检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫的crRNA及应用，属于医学检测技术领域。本发明方法设计针对两种毛滴虫18S rRNA基因的特异性RPA引物，对目标片段进行扩增，特异性的crRNA和Cas12a识别目标片段并激活Cas12a的反式切割活性，从而对被FAM和Biotin修饰的单链DNA探针进行切割。通过侧流层析试纸条T线的有无指示样品中是否含有以上两种毛滴虫；该方法快速、可视，且特异性好，灵敏度高，对设备要求较低，尤其适合在野外环境进行快速、准确的检测，为基层监控和检测人五毛滴虫和胎儿三毛滴虫感染提供了良好的技术手段。

技术研发人员：陈小庆,尧志文,张天鸿,江新成,肖淑婷,肖涛,马莹睿
受保护的技术使用者：江西农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23