一种耐热型环丙烷脂肪酸合成酶NK1-22ORF1256及其应用

本发明涉及生物合成领域，更特别地，涉及一种环丙烷脂肪酸合成酶及其应用。

背景技术：

1、环丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid，cfa)是一类含有三碳碳环的支链脂肪酸，该类脂肪酸不易氧化，兼具饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的特性，在化工领域中有特殊用途，可用于润滑及相关领域，在耐热材料制备中具有极好的包被作用，还在防腐、化妆品等领域具有应用价值。cfa纯品商业价值较高，并且其在化工领域难以化学合成，目前cfa合成还未形成产业化。在生物合成路线中，细胞通过编码环丙烷脂肪酸合成酶(cyclopropanefatty acid synthase，cfas，ec 2.1.1.79)在甲基供体s-腺苷甲硫氨酸(sam)辅助下对不饱和脂肪酸(脂)底物进行甲基化，生成具有不同碳链长度的环丙烷脂肪酸(脂)。

2、近年来，生物合成技术是颇受关注的新型合成路线，可定向合成目标化合物及化学品，在医药和化工领域具有极高的应用前景。伴随着微藻生物技术的快速发展，已经有研究者通过选育优良藻种，定向挖掘其合成基因及酶资源，以获得“细胞工厂”来代替化工合成。

3、然而，迄今本领域报道的环丙烷脂肪酸合成酶皆来源于嗜中温的植物和细菌，其生长温度一般为22℃-37℃之间，其催化温度为中、低温，在高温下极易失活变性，对环境温度、催化设备有严格限制，因此生物催化成本很高。

4、因此，在天然嗜热的种群中开发新型耐热环丙烷脂肪酸合成酶，对于突破传统环丙烷脂肪酸合成酶的催化温度桎梏，提高生物合成环丙烷脂肪酸的工业化具有重要意义。该耐热型环丙烷脂肪酸合成酶在饲料、食品、医药、生物仿生和合成生物学及微生物耐热细胞工厂构建、耐热生物育种等行业中具有广泛应用价值。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，本发明提供了一种耐热型环丙烷脂肪酸合成酶，序列如seq id no:1所示。

2、本发明还提供了上述环丙烷脂肪酸合成酶在构建具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌中的应用。

3、由于在环丙烷脂肪酸可在饲料、食品中作为添加剂，还有要用价值，因此，本发明还提供了上述环丙烷脂肪酸合成酶饲料、食品或医药的制备中的应用。

4、此外，由于本发明的环丙烷脂肪酸合成酶可用于生物仿生、环丙烷脂肪酸的合成，以及可提高宿主细胞的耐热性，因此，本发明还提供了上述环丙烷脂肪酸合成酶在生物仿生、合成生物学或耐热生物育种中的应用。本发明还提供了一种构建具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌的方法，其包括将上述环丙烷脂肪酸合成酶的基因表达框导入到出发菌株中的步骤。

5、在一个具体实施方案中，所述出发菌株可为大肠杆菌(例如大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)、codon plus(de3)-ripl、bl21 codon plus(de3)、top 10、jm109)、蓝细菌(例如聚球藻、集胞藻、鞘丝藻、螺旋藻、节旋藻等)、真核微藻(例如裂殖壶藻、紫菜、三角褐指藻)、酵母菌(例如酿酒酵母、毕赤酵母、解酯耶氏酵母)、丝状真菌。

6、在一个具体实施方案中，所述环丙烷脂肪酸合成酶的基因表达框通过表达载体导入到出发菌株中。表达载体可为细菌质粒或酵母质粒，例如，pet系列载体(如，pet-14、pet-21、pet-22、pet-28、pet-30、pet-42、pet-gst、pet-his、pet-trx、pet-gst、pet-cks、pet-dsba)，pmal系列载体(如pmal-2c)、pgex系列载体(如pgex-4t-2、pgex-6t-1)、pbad系列载体(如pbad-his、pbad-myc)、pmbp系列载体(pmbp-p、pmbp-c)、ptyb2、pqe-9、pacycduet-1、pcdfduet-1、pcoladuet-1、prsfduet-1、pllp-ompa、puc系列载体(如，puc18、puc19)，pqe-30、pxh2-1，pxh-43，ptrii，pgsf957。

7、本领域的技术人员可采用已有或将有的方法能用于构建含本发明的蛋白编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。

8、在一个具体实施方案中，所述出发菌株为大肠杆菌，所述环丙烷脂肪酸合成酶的基因表达框中，环丙烷脂肪酸合成酶编码基因的序列如seq id no:2所示。

9、在一个具体实施方案中，所述出发菌株为模式蓝细菌聚球藻，所述环丙烷脂肪酸合成酶的基因表达框中，环丙烷脂肪酸合成酶编码基因的序列如seq id no:3所示。

10、本发明还提供了通过上述方法构建得到具有利用二氧化碳为碳源光驱从头合成环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌。

11、本发明还提供了一种生产环丙烷脂肪酸的方法，包括将上述具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌与单不饱和脂肪酸孵育的步骤。

12、本发明还提供了一种生产环丙烷脂肪酸的方法，包括上述环丙烷脂肪酸合成酶与单不饱和脂肪酸孵育的步骤。

13、在一个具体实施方案中，所述底物为碳链长度为4-30的单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。

14、在一个具体实施方案中，所述底物为碳链长度为8-20的单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。在一个具体实施方案中，所述单不饱和脂肪酸为棕榈油酸和/或油酸。

15、本发明还提供了一种通过表达上述耐热型环丙烷脂肪酸合成酶提高光合细胞高温耐受性的步骤。

16、本文的表述中，将耐热型环丙烷脂肪酸合成酶与底物孵育不仅可以是直接将酶与底物以游离形式孵育。酶的提供和底物均可采用已有或将有的方式提供，例如，可将酶或底物固定在载体上提供，还可采用生产酶的宿主细胞与生产底物的宿主细胞混养，只需使酶和底物孵育到一起即可。

17、本文的表述中，将表达上述环丙烷脂肪酸合成酶的工程菌与底物孵育，不仅可以直接提供游离形式的底物，也可以提供固定在载体上的底物，还可以采用可生产底物的宿主细胞等，只需使酶和底物孵育到一起即可。

18、在一个具体实施方案中，表达上述环丙烷脂肪酸合成酶的蓝细菌可以有效提高光合细胞的高温耐受性。

19、本发明从特殊的热泉耐热蓝细菌的基因组中找到了一种具有宽泛的中温、高温催化能力的环丙烷脂肪酸合成酶，该酶催化反应的环境具有较强的适应能力，能够直接用于合成环丙烷脂肪酸或者构建具有合成环丙烷脂肪酸能力的工程菌。本发明打破了现有生物源表达环丙烷脂肪酸合成酶高温催化效率低下的壁垒，可以有效克服工业应用中对酶催化反应温度的限制，提高催化效率和产品纯度，节省催化时间，同时高温制备可避免细胞培养污染，降低催化成本，在生物催化合成环丙烷脂肪酸领域具有很广阔的工业应用前景。

技术特征：

1.一种耐热型环丙烷脂肪酸合成酶，其特征在于，序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的环丙烷脂肪酸合成酶在构建具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌中的应用或在提高光合生物耐热性中的应用。

3.权利要求1所述的环丙烷脂肪酸合成酶在饲料、食品或医药的制备中的应用，或者在生物仿生、合成生物学或耐热生物育种中的应用。

4.一种构建具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的环丙烷脂肪酸合成酶的基因表达框导入到出发菌株中的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出发菌株选自大肠杆菌、蓝细菌、真核微藻、酵母菌、丝状真菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蓝细菌选自聚球藻、集胞藻、鞘丝藻、螺旋藻、节旋藻。

7.一种具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌，其特征在于，通过权利要求4-6中任一项所述的方法构建得到。

8.一种生产环丙烷脂肪酸的方法，其特征在于，包括将权利要求7所述工程菌与底物孵育的步骤。或使用权利要求7所述的工程菌以二氧化碳为碳源光驱从头合成环丙烷脂肪酸的步骤。

9.一种生产环丙烷脂肪酸的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的环丙烷脂肪酸合成酶与底物孵育的步骤。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述底物为棕榈油酸和/或油酸。

技术总结
本发明涉及一种耐热型环丙烷脂肪酸合成酶；还涉及利用该酶构建的具有环丙烷脂肪酸合成能力的工程菌及其构建方法；还涉及上述酶和菌株在生产环丙烷脂肪酸中的应用。本发明的环丙烷脂肪酸合成酶具有宽泛的温度适应性，能够直接用于合成环丙烷脂肪酸或者构建具有合成环丙烷脂肪酸能力的工程菌，可提高催化效率和产品纯度，节省催化时间，同时高温制备可避免细胞培养污染，降低催化成本，在生物催化合成环丙烷脂肪酸领域具有很广阔的工业应用前景。本发明的耐热型环丙烷脂肪酸合成酶在饲料、食品、医药、生物仿生和合成生物学及耐热生物育种等行业中具有广泛应用价值，在生物催化合成环丙烷脂肪酸领域具有很广阔的工业应用前景。

技术研发人员：吕雪峰,齐凤霞,栾国栋,朱涛,郭勍
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23