抑制过激炎性反应的蛋白及其应用

本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及抑制过激炎性反应的重组蛋白及其在预防或治疗脓毒症中的应用。

背景技术：

1、天然免疫细胞过度激活常导致的不受控制的炎症，引起系统性病理改变，常与感染重症的高死亡率相关。因此，炎性反应须由一系列负调控因子在多个水平上严格控制，以维持免疫稳态。幼稚t细胞(t cells)已被证实在抑制β冠状病毒和革兰氏阴性菌感染的急性炎症反应中起着关键作用。t细胞通过与巨噬细胞直接接触，抑制其toll样受体(toll-like receptors，tlr)激活产生的tnf，il-6等炎性因子表达，这个过程不需要抗原特异性的t细胞受体(t cell receptor,tcr)。更为重要的是，有效控制抗原递呈细胞(antigen presenting cells,apc)，如巨噬细胞，树突状细胞或b细胞上tlr介导的炎症病理反应，取决于幼稚t细胞数量而非其质量，即免疫低下的个体感染出现的危重症和/或高病死率，与幼稚t细胞数量低直接相关。

2、细菌性和病毒性脓毒症建立的极早期，t细胞因大量死亡常出现急剧减数(tlymphopenia)，也与早期的过激炎性反应、后期的免疫麻痹等导致多器官功能失常/衰竭有关。针对脓毒症治疗，既往30多年实施的旨在增加t细胞数量、打破t细胞免疫耗竭、抑制天然免疫系统过激炎性反应(包括中和各种炎性因子)等200多种临床研究均告失败，显示了急需加大脓毒症发病机制和治疗策略研究的必要性和紧迫性。

3、cd4分子是一种跨膜蛋白，其胞外区(ectodomain)具有4个ig折叠样功能区(d1-d4)，其中远膜端d1-d2功能区与mhc-ii分子的β2功能区结合，作为tcr的辅助受体，可增强mhcii的抗原递呈与apc激活cd4+t细胞的作用。cd4分子还是hiv膜蛋白gp120的受体，介导hiv侵入并感染cd4+t细胞。

4、当cd4+t细胞激活时，cd4分子胞外域可被酶解脱落而形成可溶性cd4(solublecd4,scd4)。早期临床研究发现scd4在感染疾病、自身性免疫疾病以及癌症患者血清中检测到scd4，但其生理、病理机制未见报道。上世界90年代初开始，有大量的研究试图利用scd4蛋白及其不同衍生物来阻抑hiv感染(chen,feng et al.2014)。然而，scd4蛋白对于巨噬细胞过激炎性反应(相关的)疾病是否有调控作用，尚没有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供抑制巨噬细胞过激炎性反应的重组蛋白scd4及其在制备预防或治疗脓毒症过激炎性反应的药物组合物中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供可溶性cd4重组蛋白或表达可溶性cd4的构建体(例如表达载体，更具体例如腺病毒载体、慢病毒载体等)在制备预防或治疗炎性反应的药物组合物中的用途，其中所述的炎性反应为脓毒症(sepsis)过激炎性反应(hyperinflammation)或巨噬细胞炎性反应。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述的巨噬细胞炎性反应包括：脓毒症发生(onset)极早期，巨噬细胞tlr4介导的炎性因子过激表达性炎症。

4、在一种或多种优选实施方式中，所述巨噬细胞tlr4介导的炎性因子过激表达性炎症包括(但不限于)：tnf过度表达性炎症和/或il-6过度表达性炎症。

5、在一种或多种优选实施方式中，所述可溶性cd4重组蛋白包括cd4分子胞外区。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述cd4分子胞外区含d1、d2、d3和d4结构域。

7、在一种或多种优选实施方式中，所述可溶性cd4重组蛋白由人源或鼠源的经基因密码子优化的编码序列编码获得。

8、在一种或多种优选实施方式中，所述可溶性cd4重组蛋白包括seq id no:1或seqid no:3所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变体(保留有seq id no:1或seq id no:3所示蛋白质序列和功能的变体)。

9、在一种或多种优选实施方式中，所述保守性变体包括选自：(1)将seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白功能的衍生蛋白；(2)氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上、90％以上或95％以上；如98％以上或99％以上)相同性，且保留seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白功能的衍生蛋白；或，(3)在seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白(如在n或c末端)添加标签序列，或添加信号肽序列后形成的蛋白。

10、在一种或多种优选实施方式中，所述保守性变体选自(但不限于)：包含利于检测seq id no:1或seq id no:3所示蛋白质的小肽标签的变体，和/或增加seq id no:1或seqid no:3所示蛋白质稳定性的fc融合重组变体。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述表达可溶性cd4的构建体包括(但不限于)：表达载体。

12、在一种或多种优选实施方式中，所述表达载体包括：病毒性表达载体、非病毒性表达载体。

13、在一种或多种优选实施方式中，所述病毒性表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述可溶性cd4通过结合巨噬细胞mhc ii，交叉抑制所述炎性反应；较佳地所述炎性反应包括：为脓毒症(sepsis)过激炎性反应(hyperinflammation)或巨噬细胞炎性反应；更佳地，所述巨噬细胞炎性反应为巨噬细胞tlr4炎性反应。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述tlr4炎性反应藉由的信号通路为巨噬细胞mhc ii-tlr4炎性反应复合体；较佳地，包括：所述可溶性cd4重组蛋白或表达可溶性cd4的构建体上调mhc ii，募集和激活shp-2，抑制traf6，从而交叉抑制tlr4/nf-κb介导的炎性反应。

16、在一种或多种优选实施方式中，所述可溶性cd4重组蛋白或表达可溶性cd4的构建体被包含于药学上可接受的载体中，形成药物组合物。

17、在本发明的另一方面，提供人工建立的或存在于细胞内的信号通路或含有该信号通路的体系的用途，用于筛选抑制巨噬细胞炎性反应的物质(包括化合物，组合物，药物等)；所述信号通路选组下组：巨噬细胞mhc ii-shp2和/或sting-traf6-tlr4；巨噬细胞mhcii-tlr4；巨噬细胞shp2-traf6-tlr4；巨噬细胞sting-tlr4。

18、在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制巨噬细胞炎性反应的物质的方法，包括：

19、(1)将候选物质与含有选组下组的信号通路的体系接触：巨噬细胞mhc ii-shp2和/或sting-traf6-tlr4；巨噬细胞mhc ii-tlr4；巨噬细胞shp2-traf6-tlr4；巨噬细胞sting-tlr4；

20、(2)观测(1)的体系，筛选出调节(1)的信号通路的物质，所述物质是对于抑制巨噬细胞炎性反应有用的物质(包括潜在物质)；其中，所述的调节包括：上调(如激活或提高表达)mhc ii，上调shp2，上调sting，下调(如抑制或降低表达)traf6。

21、在一种或多种实施方式中，(1)中所述信号通路为巨噬细胞mhc ii-shp2-traf6-tlr4；(2)中所述的调节包括：上调mhc ii，上调shp2，所述shp2下调traf6，从而抑制tlr4炎性反应。

22、在一种或多种实施方式中，(1)中所述信号通路为巨噬细胞mhc ii-tlr4；(2)中所述的调节包括：上调mhc ii，从而抑制tlr4炎性反应。

23、在一种或多种实施方式中，(1)中所述信号通路为shp2-traf6-tlr4；(2)中所述的调节包括：上调shp2，所述shp2下调traf6，从而抑制tlr4炎性反应。

24、在一种或多种实施方式中，(1)中所述信号通路为sting-tlr4；(2)中所述的调节包括：上调sting，从而抑制tlr4炎性反应。

25、在一种或多种实施方式中，所述方法还包括设置对照组，所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有选组下组的信号通路的体系：巨噬细胞mhc ii-shp2和/或sting-traf6-tlr4；巨噬细胞mhc ii-tlr4；巨噬细胞shp2-traf6-tlr4；巨噬细胞sting-tlr4。

26、在一种或多种实施方式中，所述体系中还包括tlr4下游的myd88/irak1/traf6的炎性信号传导分子；从而，所述方法还包括：观测tlr4下游的myd88/irak1/traf6的炎性信号传导分子的激活情况，若其激活被抑制，则表明所述候选物质为对于抑制巨噬细胞炎性反应有用的物质。

27、在一种或多种实施方式中，所述体系中还包括nf-b，其驱动tnf/il-6等炎性因子基因表达；从而，所述方法还包括：观测nf-b驱动炎性因子(如tnf/il-6等)表达，若表达下降，则表明所述候选物质为对于抑制巨噬细胞炎性反应有用的物质。

28、在一种或多种实施方式中，所述tlr4炎性反应的抑制情况根据炎症因子表达或存在情况而评价；较佳地，所述炎症因子包括：tnf和/或il-6；若tnf和/或il-6的表达或存在无显著变化(例如，与对照相比未发生显著下调)则tlr4炎性反应未被抑制，若tnf和/或il-6的表达显著下降则tlr4炎性反应能被抑制。

29、在一种或多种实施方式中，所述含有信号通路的体系选自：胞(培养物)体系、亚细胞(培养物)体系、组织(培养物)体系或动物体系。

30、在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述信号通路或其通路蛋白、或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如但不限于上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，crispr构建物，小分子化合物，来自化合物库的化合物。

31、在一种或多种实施方式中，所述的提高或促进为统计学上的提高或促进，如与对照或基底相比，提高或促进10％或20％以上，较佳地提高或促进40％或50％以上，更佳地提高或促进80％或100％以上。

32、在一种或多种实施方式中，所述的抑制为下调的一种，为统计学上的抑制或下调，如与对照或基底相比，抑制或下调10％或20％以上，较佳地抑制或下调40％或50％以上，更佳地抑制或下调80％或100％以上。

33、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

技术特征：

1.可溶性cd4重组蛋白或表达可溶性cd4重组蛋白的构建体在制备预防或治疗炎性反应的药物组合物中的用途，其中所述的炎性反应为脓毒症过激炎性反应或巨噬细胞炎性反应。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的巨噬细胞炎性反应包括：脓毒症发生极早期，巨噬细胞tlr4介导的炎性因子过激表达性炎症；较佳地，所述巨噬细胞tlr4介导的炎性因子过激表达性炎症包括：tnf过度表达性炎症和/或il-6过度表达性炎症。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可溶性cd4重组蛋白包括cd4分子胞外区；较佳地，所述cd4分子胞外区含d1、d2、d3和d4结构域；较佳地，所述可溶性cd4重组蛋白由人源或鼠源的经基因密码子优化的编码序列编码获得。

4.如权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述可溶性cd4重组蛋白包括seq id no:1或seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白或其保守性变体；较佳地，所述保守性变体包括选自：

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述保守性变体选自：包含利于检测seq idno:1或seq id no:3所示蛋白质的小肽标签的变体，和/或增加seq id no:1或seq id no:3所示蛋白质稳定性的fc融合重组变体。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述表达可溶性cd4的构建体包括：表达载体；较佳地，所述表达载体包括：病毒性表达载体、非病毒性表达载体；更佳地，所述病毒性表达载体包括：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可溶性cd4通过结合巨噬细胞mhcii，交叉抑制所述炎性反应；较佳地所述炎性反应包括：为脓毒症过激炎性反应或巨噬细胞炎性反应；更佳地，所述巨噬细胞炎性反应为巨噬细胞tlr4炎性反应。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述tlr4炎性反应藉由的信号通路为巨噬细胞mhcii-tlr4炎性反应复合体；较佳地，包括：所述可溶性cd4重组蛋白或表达可溶性cd4的构建体上调mhc ii，募集和激活shp-2，抑制traf6，从而交叉抑制tlr4/nf-κb介导的炎性反应。

9.人工建立的或存在于细胞内的信号通路或含有该信号通路的体系的用途，用于筛选抑制巨噬细胞炎性反应的物质(包括化合物，组合物，药物等)；所述信号通路选组下组：

10.一种筛选抑制巨噬细胞炎性反应的物质的方法，包括：

技术总结
本发明揭示了抑制过激炎性反应的蛋白及其应用。所述的蛋白包括可溶性CD4分子(sCD4)，所述的应用包括预防或治疗脓毒症过激炎性反应或巨噬细胞过激炎性反应。本发明也揭示了sCD4抑制巨噬细胞过激炎性反应的作用靶点为细胞膜型MHC II，所述sCD4通过调节MHCII/STING/SHP2复合物发挥作用。

技术研发人员：唐宏,石丽娜,张胜源,徐秋平,袁峰,李凤莺,黄劼
受保护的技术使用者：中国科学院上海巴斯德研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23