一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法及其应用与流程
本发明关于中药分析，尤其涉及一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法及其应用。
背景技术：
1、甘草来源于豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis fisch.、胀果甘草g.inflatabat.或光果甘草g.glabra l.的干燥根和根茎，素有“国老”的美誉，最早见于《神农本草经》，在中药传统方剂中承担着调和其他药性的作用。此外，甘草也被广泛应用于食品、农业、化工等领域，可作为甜味剂、美白剂与表面活性剂等。
2、甘草中含有丰富的黄酮、三萜、游离酚酸和多糖等生物活性成分。其中，异黄酮类化合物，如甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷等作为豆科植物的特征成分，可作为防御化合物对抗几种生物，易与根瘤菌形成固氮共生关系，具有抗病毒、抗氧化、降血糖等药理活性。三萜皂苷类化合物，如甘草酸具有抗病毒、抗炎和美白等活性，是甘草中的主要甜味成分之一。甘草中酚酸类主要具有抗氧化和抗肿瘤的生物活性。多糖作为甘草的另一类主要生物活性成分，具有增强免疫力、抗肿瘤、降糖、抗炎等生物活性。近年来关于甘草质量控制的研究主要集中在多类别化学成分的表征、多成分含量测定和差异标志物研究等，尤其是液相-质谱联用(lc-ms)技术结合代谢组学差异分析方法、多维色谱等分析技术体现出了整体性的优势。然而，这些方法无法提供上述活性小分子或大分子多糖的空间分布信息。
3、质谱成像(mass spectrometry imaging，msi)是以质谱技术为基础的成像方法，该方法通过质谱直接扫描生物样品成像，可以在同一张组织切片或组织芯片上同时分析数百种分子的空间分布特征。目前应用较多的是解析电喷雾离子化质谱成像(desi-msi)与基质辅助激光解析电离质谱成像(maldi-msi)。利用质谱成像技术研究各类别生物活性成分(如活性小分子与大分子多糖)在甘草根与根茎中的分布，有助于研究不同代谢物在植物中的生态生理作用，同时有助于从特定部位提取目标成分，有效提高甘草的利用率。目前有研究者使用maldi-msi实现了甘草根茎中几类代表性成分的空间分布位置可视化，但所揭示的成分较少，且没有涉及寡糖类成分的空间分布研究。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本发明提供一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，该方法基于高分辨质谱的解吸电喷雾电离质谱成像(desorptionelectrospray ionization mass spectrometry imaging，desi-msi)技术，能够精确定位甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的空间分布信息，可用于观察不同化合物在甘草根或根茎中的分布模式。
2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
3、一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，所述小分子成分包括黄酮类化合物和皂苷类化合物；所述质谱成像方法具体包括以下步骤：
4、s1、将甘草根或根茎部待测样品包埋后冷冻，切片，厚度为40～50μm；
5、s2、将s1所得切片利用desi-msi仪器进行数据采集和分析，喷雾溶剂为95％～100％v/v甲醇。
6、本发明采用的desi-msi技术可直接实现样品组织电离且无需复杂样品前处理，基本不改变待测样品中小分子成分和寡糖成分的空间分布信息；将采集得到的数据通过desi-msi仪器自带的hdi软件进行分析，能够精确地定位单个化合物的空间分布信息，实现甘草根或根茎内部化学成分的可视化。该方法能高效、准确地识别植物中特异性成分的差异分布，为揭示甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的分布积累提供了依据，对甘草根或根茎组织中代谢物的生态生理作用研究提供了新的维度，对药用成分在植物中的定位检测和工业生产具有重要意义。
7、样品的前处理和切片的影响desi-msi的数据采集、分析时的信号质量以及空间分辨率。针对甘草根或根茎的植物形态特点，本发明选择先包埋后再冷冻、切片，以获得完整切片，避免皱缩或者表皮脱落的情况。
8、结合第一方面，s1中包埋所用的包埋剂为cmc-na(羧甲基纤维素钠)溶液，浓度优选采用2.5％wt。cmc-na溶液相对其它常用包埋剂来说，对甘草根或根茎样品检测和信号强度影响较小。
9、优选地，s1中冷冻时间优选为25～35min。
10、优选地，s1中切片时切片机的箱体温度为-20℃，样品头温度设置为-18℃，以确保切片时甘草根或根茎样品硬度适中且切片后样品不易液化和发生皱缩，能够平整地贴合载玻片。
11、结合第一方面，s1中切片的厚度为40μm。
12、结合第一方面，当检测小分子成分时，s1还包括将所得切片用有机溶剂浸泡处理，取出后自然晾干，所述有机溶剂选自丙酮或异丙醇。用上述有机溶剂对甘草根或根茎组织切片进行浸泡能够清除组织中甘草根或根茎中的生理盐和大部分脂质成分，同时稳定切片中蛋白质含量，提高目标成分的信号强度，延长切片的保存时间。
13、优选地，所述有机溶剂为异丙醇。异丙醇浸泡后总离子强度最高，成像效果更好。
14、结合第一方面，当检测寡糖成分时，s1还包括将所得切片用浓度≤0.5m的三氟乙酸熏蒸处理。
15、优选地，熏蒸的温度为50～60℃，时间为20～40min。进一步优选的熏蒸温度为60℃，时间为30min。
16、结合第一方面，当检测小分子成分时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂中还含有0～0.105mm氯化铵的95％～100％v/v甲醇溶液，优选采用含有0.095～0.105mm氯化铵的95％v/v甲醇溶液作为检测小分子成分时的喷雾溶剂。
17、结合第一方面，当检测寡糖成分时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂中还含有0～0.105％v/v甲酸、0～0.105mm氯化铵、0～0.0101mm三氟乙酸或0～0.105mm醋酸铵。优选采用含有0.095％～0.105％v/v甲酸的95％v/v甲醇溶液作为检测寡糖成分时的喷雾溶剂。
18、结合第一方面，当检测寡糖成分时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂还可替换为乙腈。
19、结合第一方面，所述解吸电喷雾电离质谱成像的质谱条件包括：在负离子模式下采集，毛细管电压为4.5～5.0kv，锥孔电压为60v，离子源温度为130℃。毛细管电压更优选择为4.5kv。
20、第二方面，本发明还提供上述甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法在确定甘草根或根茎中小分子成分空间分布中的应用，所述小分子成分包括黄酮类化合物和皂苷类化合物。
21、第三方面，本发明还提供上述甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法在确定甘草根或根茎中寡糖成分空间分布中的应用。
22、本发明的有益效果在于：本发明通过desi-msi技术，通过优化的样品预处理方法、喷雾溶剂和质谱参数，一方面，能够从甘草根或根茎中检测到较多小分子成分，如黄酮类、皂苷类及其他小分子等，从而有助于我们理解不同化学成分在植物中的生态生理作用，如黄酮类化合物的直观分布状态有助于我们理解植物自身防御功能和固氮共生关系；另一方面，还得到了不同聚合度寡糖在甘草根或根茎中的分布，从而获得寡糖无标记原位空间分布信息和相对丰度。本发明实现了甘草根或根茎中不同类型化学成分和原位酸水解所得寡糖的详细空间分布信息的获取，既能够通过植物代谢物的不同分布位置来研究其在植物生长发育过程中的生理作用，又能够提高甘草中活性成分的分离提取率和甘草根或根茎组织的利用率。该方法有望应用于植物研究、工业生产和药物应用等领域。
技术特征：
1.一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，所述小分子成分包括黄酮类化合物和皂苷类化合物；所述质谱成像方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，s1中包埋所用的包埋剂为cmc-na溶液；和/或
3.根据权利要求1所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，当检测小分子成分时，s1还包括将所得切片用有机溶剂浸泡处理，取出后自然晾干，所述有机溶剂选自丙酮或异丙醇。
4.根据权利要求1所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，当检测寡糖成分时，s1还包括将所得切片用浓度≤0.5m的三氟乙酸熏蒸处理。
5.根据权利要求4所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，熏蒸的温度为50～60℃，时间为20～40min。
6.根据权利要求1所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，当检测小分子成分时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂中还含有0～0.105mm氯化铵的95％～100％v/v甲醇溶液；和/或
7.根据权利要求6所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，当检测小分子成分时，喷雾溶剂为含有0.095～0.105mm氯化铵的95％v/v甲醇溶液；和/或
8.根据权利要求1所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，当检测寡糖成分时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂替换为乙腈。
9.根据权利要求1～8任一项所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法，其特征在于，所述解吸电喷雾电离质谱成像的质谱条件包括：在负离子模式下采集，毛细管电压为4.5～5.0kv，锥孔电压为60v，离子源温度为130℃。
10.权利要求1～9任一项所述的甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法的应用，其包括以下任一项应用：
技术总结
本发明关于中药分析技术领域，尤其涉及一种甘草根或根茎中小分子成分和寡糖成分的质谱成像方法及其应用。本发明将甘草根或根茎部待测样品包埋后冷冻，切片，厚度为40～50μm，然后将所得切片利用解吸电喷雾电离质谱成像技术进行数据采集和分析，获得小分子成分和寡糖成分的空间分布信息。本发明无需复杂样品前处理，基本不改变待测样品中小分子成分和寡糖成分的空间分布信息，并能够精确地定位单个化合物的空间分布信息，实现甘草根或根茎内部化学成分的可视化。该方法既能够通过植物代谢物的不同分布位置来研究其在植物生长发育过程中的生理作用，又能够提高甘草中活性成分的分离提取率和甘草根或根茎组织的利用率，有望应用于植物研究、工业生产和药物应用等领域。
技术研发人员：杨文志,赵雨营,刘美玉,李雪,胡莹,杨飞飞,姜美婷,徐晓艳,王薇,荆绮,王洪达
受保护的技术使用者：现代中医药海河实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23