一种凝血检测试剂盒、癌症病人的血栓风险评估系统

本发明涉及医疗检测。更具体地，涉及一种凝血检测试剂盒、癌症病人的血栓风险评估系统。

背景技术：

1、深静脉血栓是形成于深静脉血管/静脉瓣中的血液凝块，若其从原发部位脱落后，会随静脉在内循环中运动，若移动到脑、肺、心脏等重要器官，甚至会引发猝死。但如此危险的血栓，却因其症状不明显，极易被误诊从而耽误治疗。目前，血栓常用的诊断方法为超声检查以及血液中d-dimer含量测试。其中，超声方法所需时间较长，所需设备昂贵，较难看到微小血栓，需受系统培训的操作员，且花费巨大，仍仅能作为少数癌症病人的常规血栓检测方法。而d-dimer含量测试则因含量变化剧烈使得特异性较差，并且只能在血栓发生后进行检测，此时病人风险已经较大，难以进行早期介入。

2、癌症病人血栓的形成极大程度归因于肿瘤分泌的凝血物质，会使得静脉血液处于易凝血状态，从而极易形成血栓。目前研究表明，凝血物质含量的增加会更容易形成血栓，血栓体积更大。这些现象让这类凝血物质成为检测癌症病人血栓的可行的生物标记物，但目前这类凝血物质的分离方法大多步骤繁琐，耗时极长，试剂昂贵，仅停留在实验室中，较难广泛的应用于常规临床检测流程中。

3、因此，急需一种快速、直观、高效、高准确率的凝血检测产品以辅助医疗工作者评估癌症病人的血栓风险，用于指导进一步的临床检测与疾病诊断。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种凝血检测试剂盒。

2、本发明的第二个目的在于提供一种凝血检测试剂盒的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供一种包含上述凝血检测试剂盒的癌症病人的血栓风险评估系统。

4、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

5、第一方面，本发明提供一种凝血检测试剂盒，包括：凝血检测芯片和一系列凝血能力指示剂；

6、其中，所述凝血检测芯片包括基底及在基底表面的阵列；所述阵列由疏水区域和凝血区域交替排列形成；所述凝血区域的表面分布有二氧化钛纳米结构；

7、所述一系列凝血能力指示剂中含有梯度浓度的凝血剂，以及等浓度的血红细胞分散液。

8、需要说明的是，所述疏水区域用于将凝血区域间隔开，避免相邻凝血区域相互影响；所述疏水区域和凝血区域的形状可以根据实际情况调整，例如相同或不同面积的正方形、长方形、三角形等；所述疏水区域和凝血区域的数量可以根据实际情况调整；所述凝血能力指示剂是指能与凝血物质显色的指示剂，可以理解，一系列凝血能力指示剂是指不同显色能力的指示剂，在本发明中，仅通过调节凝血剂的浓度来获得不同显色能力的凝血能力指示剂(优选为梯度浓度的凝血剂，例如梯度浓度为0.6mg/ml)。

9、此外，本发明的凝血检测试剂盒的检测原理是：将待测血浆滴加到所有凝血区域，凝血区域表面的二氧化钛纳米结构与血浆中凝血相关物质(主要是外泌体类)发生相互作用，从而将其分离出来，随后将不同显色能力的凝血能力指示剂分别滴加到不同的凝血区域，凝血能力指示剂遇凝血相关物质显色；我们最终可以观察到部分凝血区域显色，将其显色的区域数计为阳性分数。可以理解，阳性分数越高代表凝血相关物质浓度越高，即患者血液中的凝血物质含量越高。

10、优选地，所述二氧化钛纳米结构为纳米线、纳米孔、纳米褶皱、纳米纤毛和纳米花中的任一种或多种，优选为纳米花。其中纳米花结构的二氧化钛可以更快、更好的分离凝血相关物质，例如肿瘤分泌的外泌体、促凝的组织因子蛋白等。

11、优选地，所述二氧化钛纳米结构为纳米花时，纳米花的粒径为300-400nm，单个二氧化钛晶体的直径为15-30nm，可以理解，纳米花由多个二氧化钛晶体单元组成。

12、优选地，所述二氧化钛纳米结构为纳米花时，凝血区域的表面分布二氧化钛纳米结构的体积密度为60-100％。

13、优选地，所述红细胞血浆分散液的分散剂为标准人血浆、pbs缓冲液或生理盐水，分散质为血红细胞，例如小鼠红细胞。

14、在本发明的一个具体实施例中，所述血红细胞血浆分散液与所述凝血剂的体积为1:1，所述血红细胞血浆分散液中，分散剂与分散质的体积比为1:1。

15、优选地，所述凝血检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

16、制备亲疏水图案化基底：将基底进行亲水处理，之后进行疏水化修饰，覆盖图案化掩膜版，再次亲水处理后，去掉掩膜版即获得具有亲疏水图案化的基底；

17、生长二氧化钛纳米花结构：异丙醇钛与盐酸进行搅拌反应，配置溶液a；

18、配置十六烷基三甲基溴化铵的水溶液，作为b溶液；

19、将溶液b缓慢滴入溶液a中，随后搅拌以获得溶液c；

20、乙二醇、尿素依次滴加到溶液c中，获得溶液d；

21、将溶液d移入所述具有亲疏水图案化的基底的反应釜中，进行二次热处理。

22、优选地，所述疏水化修饰为使用1h,1h,2h,2h-全氟癸基三甲氧基硅烷进行修饰。

23、优选地，所述异丙醇钛与盐酸的质量比为1.5-2:50-60，搅拌反应的时间为20-40分钟。

24、优选地，所述c溶液中，十六烷基三甲基溴化铵与异丙醇钛粉的质量比为0.5-1:1.5-2。

25、优选地，所述乙二醇、尿素和异丙醇钛粉的比为150-170ml:0.6-0.8g:1.5-2g。

26、优选地，所述二次热处理包括在150-170℃反应3-10小时，随后在550-600℃反应2-3小时的步骤。

27、在上述方法中，根据不同的反应时间，可以调控二氧化钛纳米结构的密度及大小。

28、第二方面，本发明提供一种上述凝血检测试剂盒在以下任一中的应用：

29、(1)制备检测凝血物质含量的产品；

30、(2)制备检测癌症病人血栓风险的产品。

31、第三方面，本发明提供一种癌症病人的血栓风险评估系统，包括上述凝血检测试剂盒和计算机设备；所述计算机设备包括预测评估模块；

32、所述试剂盒，用于对癌症病人的血浆进行凝血检测，获得阳性分数；

33、所述预测评估模块，包括一种癌症病人的血栓风险预测模型；用于根据将所述阳性分数及癌症病人的临床信息输入已训练的血栓风险预测模型，获得癌症病人的血栓风险评分。

34、优选地，所述血栓风险预测模型为logistic、svm、lasso、adaboost和rf模型中的任一种，优选为adaboost模型。其中，本发明发现adaboost模型获得的癌症病人的血栓风险评分准确度更高。

35、adaboost，是英文"adaptive boosting"(自适应增强)的缩写，它的自适应在于：前一个基本分类器分错的样本会得到加强，加权后的全体样本再次被用来训练下一个基本分类器。同时，在每一轮中加入一个新的弱分类器，直到达到某个预定的足够小的错误率或达到预先指定的最大迭代次数。具体说来，整个adaboost迭代算法就3步：

36、1.初始化训练数据的权值分布。如果有n个样本，则每一个训练样本最开始时都被赋予相同的权值：1/n。

37、2.训练弱分类器。具体训练过程中，如果某个样本点已经被准确地分类，那么在构造下一个训练集中，它的权值就被降低；相反，如果某个样本点没有被准确地分类，那么它的权值就得到提高。然后，权值更新过的样本集被用于训练下一个分类器，整个训练过程如此迭代地进行下去。

38、3.将各个训练得到的弱分类器组合成强分类器。各个弱分类器的训练过程结束后，加大分类误差率小的弱分类器的权重，使其在最终的分类函数中起着较大的决定作用而降低分类误差率大的弱分类器的权重，使其在最终的分类函数中起着较小的决定作用。换言之，误差率低的弱分类器在最终分类器中占的权重较大，否则较小。

39、优选地，所述癌症病人的临床信息包括d-dimer浓度、癌症类型和性别。

40、优选地，所述癌症病人的临床信息还包括癌症病人年龄、肿瘤分期血糖、血脂、血压等临床数值中的一种或多种。

41、在本发明的一个具体实施例中，可以将所述预测评估模块训练获得的血栓风险预测模型整合为线列图(nomogram)卡片伴随试剂盒使用，将优选的d-dimer浓度、癌症类型、性别和患者阳性分数四种参数在线列图上对应，向下划线获得参数对应分数，四种分数相加或者总分，总分向下对应为血栓风险，根据roc曲线上各个点的约登指数最大值确认血栓风险cutoff值，然后据此分为红绿两区域，在绿色区域(小于cutoff值)则表明病人具有低血栓风险，在红色区域(大于cutoff值)则表明病人具有高血栓风险，需要进行更深入的临床血栓检查。

42、本发明的有益效果如下：

43、1、本发明的凝血检测试剂盒可以快速分离血浆中的肿瘤分泌促凝物质(外泌体等)，原位可视化地检测测试者的凝血物质含量，这对降低血栓检测成本、提高血栓检测效率具有重要意义。

44、2、本发明提供的凝血检测试剂盒制备工艺简单、操作方便，适合大规模生产应用。

45、3、本发明基于上述凝血检测试剂盒进一步提供了一种癌症病人的血栓风险评估系统，该系统利用机械学习辅助的数据处理，实现了对癌症病人血栓风险的高灵敏度(95.0％)，高特异性(99.0％)和高准确率(98.3％)检测，为临床诊断、跟踪癌症病人血栓风险提供全新、准确且稳定的新思路。

技术特征：

1.一种凝血检测试剂盒，其特征在于，包括：凝血检测芯片和一系列凝血能力指示剂；

2.如权利要求1所述的凝血检测试剂盒，其特征在于，所述二氧化钛纳米结构为纳米线、纳米孔、纳米褶皱、纳米纤毛和纳米花中的任一种或多种，优选为纳米花。

3.如权利要求2所述的凝血检测试剂盒，其特征在于，所述二氧化钛纳米结构为纳米花时，纳米花的直径为300-400nm，单个二氧化钛晶体的直径为15-30nm。

4.如权利要求2所述的凝血检测试剂盒，其特征在于，所述二氧化钛纳米结构为纳米花时，凝血区域的表面分布二氧化钛纳米结构的体积密度为60-100％。

5.如权利要求1所述的凝血检测试剂盒，其特征在于，所述血红细胞分散液的分散剂为标准人血浆、pbs缓冲液或生理盐水，优选为标准人血浆，分散相为血红细胞。

6.如权利要求2所述的凝血检测试剂盒，其特征在于，当所述二氧化钛纳米结构为纳米花时，所述凝血检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

7.一种如权利要求1-6任一所述的凝血检测试剂盒在以下任一中的应用：

8.一种癌症病人的血栓风险评估系统，其特征在于，包括权利要求1-6任一所述的凝血检测试剂盒和计算机设备；所述计算机设备包括预测评估模块；

9.根据权利要求8所述的血栓风险评估系统，其特征在于，所述血栓风险预测模型为logistic、svm、lasso、adaboost和rf模型中的任一种，优选为adaboost模型。

10.根据权利要求8所述的血栓风险评估系统，其特征在于，所述癌症病人的临床信息包括d-dimer浓度、癌症类型和性别；优选地，所述癌症病人的临床信息还包括癌症病人年龄、肿瘤分期血糖、血脂、血压等临床数值中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种凝血检测试剂盒、癌症病人的血栓风险评估系统，所述血检测试剂盒包括：凝血检测芯片和一系列凝血能力指示剂；其中，所述凝血检测芯片包括基底及在基底表面的阵列；所述阵列由疏水区域和凝血区域交替排列形成；所述凝血区域的表面分布有二氧化钛纳米结构；所述一系列凝血能力指示剂中分别含有梯度浓度的凝血剂，以及等浓度的血红细胞分散液。进一步，本发明还提供一种包括上述凝血检测试剂盒癌症病人的血栓风险评估系统，该系统利用机械学习辅助的数据处理，实现了对癌症病人血栓风险的高灵敏度(95.0％)，高特异性(99.0％)和高准确率(98.3％)检测，为临床诊断、跟踪癌症病人血栓风险提供全新、准确且稳定的新思路。

技术研发人员：王树涛,闵力,包寒,孟靖昕,张澍田
受保护的技术使用者：中国科学院理化技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23