抗PD-L1的纳米抗体及其用途

本发明涉及免疫学及肿瘤学领域，具体涉及抗pd-l1的纳米抗体或其抗原结合片段，编码所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸分子及包含其的宿主细胞。本发明还涉及包含所述纳米抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体、缀合物和药物组合物，以及它们在治疗肿瘤中的用途。

背景技术：

1、恶性肿瘤严重危害人类健康，传统的肿瘤临床治疗手段主要包括手术治疗、放疗及化疗，靶向治疗等。随着肿瘤免疫疗法的快速发展，诸多具有治疗作用的新靶点被成功开发运用于肿瘤免疫治疗。基于靶向阻断pd-1/pd-l1免疫抑制性信号通路的抑制剂，在临床治疗中取得重要进展，为肿瘤治疗带来新的范式转变。

2、细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，cd274)或b7同源体(b7 homolog 1，b7-h1)，由cd274基因进行编码的一种i型跨膜蛋白。pd-l1是pd-1已知的主要配体，其细胞外结构域由igc型和igv型构成，胞质内有短的胞质尾，没有信号转导基序(freeman gj,long aj,iwai y,et al.engagement of the pd-1immunoinhibitory receptor by anovel b7 family member leads to negative regulation of lymphocyteactivation.j exp med.2000oct 2；192(7):1027-34.)。pd-l1除了在多种恶性肿瘤组织中有较高的表达外，还广泛于树突状细胞、巨噬细胞、b淋巴细胞和骨髓来源的肥大细胞以及多种非造血细胞类型中表达，包括血管内皮细胞、上皮细胞、胎盘滋养层细胞等(rebelattom c,midha a,mistry a,sabalos c,schechter n,li x,et al.development of aprogrammed cell death ligand-1immunohistochemical assay validated foranalysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cellcarcinoma[j].diagn pathol,2016,11:95.)。

3、在生理条件下，pd-l1在多种类型的细胞和组织中表达，并表现为免疫激活可诱导过度表达的表型，pd-1/pd-l1信号通路的激活不但与机体移植排斥反应、慢性病毒感染以及自身免疫性疾病等密切相关，而且还参与肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤细胞生长等过程(okazaki,t.,honjo,t.pd-1and pd-1ligands:from discovery to clinicalapplication[j].int immunol,2007,19(7):813-24.)。

4、在1993年，比利时布鲁塞尔自由大学hamers-casterman与其研究团队首次发现在骆驼科动物血液中存在一种缺失轻链，仅有重链的抗体形式，该抗体形式被称为单域抗体(single-domain antibodies)或纳米抗体(nanobodies，nbs)(hamers-casterman c,atarhouch t,muyldermans s,et al.naturally occurring antibodies devoid oflight chains.nature.1993，363(6428):446-8.)。nbs保留了完整的抗原结合能力，与传统抗体相比，纳米抗体具有高亲和力，高稳定性，渗透性强，可识别隐蔽表位等优势，由于其具有独特的稳定性和生物活性，为疾病的诊断和治疗提供了新的策略。

5、最近的研究表明，靶向pd-1/pd-l1信号通路的抗体已被用于治疗高突变负荷肿瘤患者，并展示出持久的抗肿瘤效果。然而，现有的pd-l1阻断免疫疗法仍存在一些瓶颈，例如亲和力低，给药剂量大，组织穿透效率低等，限制了其在临床上的应用和疗效。因此，需要开发新的高亲和力的pd-l1阻断抗体及新的抗体形式，以提高其抗肿瘤疗效。

技术实现思路

1、本技术的发明人经过大量的研究，筛选获得了抗pd-l1的单克隆纳米抗体，其对pd-l1分子具有良好的亲和力和阻断pd-l1/pd-1结合的活性。进一步的，所述pd-l1纳米抗体能够特异的结合细胞表面的pd-l1分子；在表达人源pd-l1的小鼠肿瘤模型中，该pd-l1纳米抗体能够显著抑制肿瘤的生长。因此，本发明的抗pd-l1的纳米抗体在肿瘤的靶向治疗及诊断领域具有巨大的潜力，可用于多种目的，例如作为肿瘤的治疗药物、诊断试剂等。

2、纳米抗体及其抗原结合片段

3、因此，在一个方面，本技术提供了能够特异性结合pd-l1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

4、包含下述3个互补决定区(cdrs)的重链可变区(vhh)：

5、(i)cdr1，其由下述序列组成：seq id no:5，或与seq id no:5相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

6、(ii)cdr2，其由下述序列组成：seq id no:7，或与seq id no:7相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

7、(iii)cdr3，其由下述序列组成：seq id no:9，或与seq id no:9相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

8、在某些实施方案中，所述置换为保守置换。

9、在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如seq id no:5所示的cdr1；如seq id no:7所示的cdr2；以及，如seq id no:9所示的cdr3。

10、在某些实施方案中，所述的纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：

11、(i)seq id no:3所示的序列；

12、(ii)与seq id no:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

13、(iii)与seq id no:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

14、在某些实施方案中，所述置换为保守置换。

15、在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含驼源重链抗体的框架区或源自人免疫球蛋白的重链框架区。

16、在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：seq id no:4所示的fr1、seq id no:6所示的fr2、seq id no:8所示的fr3、以及seq id no:10所示的fr4。

17、双特异性或多特异性抗体

18、在另一方面，本技术还提供了双特异性或多特异性抗体，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段。

19、在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合pd-l1，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

20、在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。

21、分离的核酸分子

22、在另一方面，本技术还提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段。

23、载体

24、在另一方面，本技术还提供了载体，其包含如上所述的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。

25、宿主细胞

26、在另一方面，本技术还提供了宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是微生物。

27、制备方法

28、本发明的纳米抗体或多肽构建体或融合蛋白可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明纳米抗体的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转化/转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转化/转染后的宿主细胞，并表达本发明的纳米抗体。

29、本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的纳米抗体分子获得(参见morimotoet al.,j.biochem.biophys.methods 24:107-117(1992)and brennan et al.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inhudson,curr.opin.immunol.11:548-557(1999)；little et al.,immunol.today,21:364-370(2000))。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

30、在另一方面，本技术还提供了制备如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段。

31、缀合物

32、在一方面，本技术还提供了缀合物，其包含如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如前所述的双特异性或多特异性抗体，以及偶联部分。

33、在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(例如his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp)；可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(例如化学发光物质)，生物素)；治疗剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)；或，另外的生物活性多肽。

34、药物组合物

35、在一方面，本技术还提供了药物组合物，其包含如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如前所述的双特异性或多特异性抗体、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、或如前所述的缀合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

36、在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。

37、杀伤细胞的方法

38、在一方面，本技术还提供了一种抑制表达pd-l1的肿瘤细胞生长和/或杀伤所述肿瘤细胞的方法，其包括将如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如前所述的双特异性或多特异性抗体、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、或如前所述的缀合物或如前所述的药物组合物接触。

39、在某些实施方案中，所述方法在体内进行，或在体外进行。

40、用途

41、在一方面，本技术还提供了如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如前所述的双特异性或多特异性抗体、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、或如前所述的缀合物或如前所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗肿瘤。

42、在某些实施方案中，所述肿瘤表达pd-l1蛋白(即pd-l1阳性)。

43、在某些实施方案中，所述肿瘤涉及pd-l1的肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述pd-l1在所述肿瘤细胞表面上表达。

44、在某些实施方案中，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿(mycosis fungoids)、默克尔细胞癌和其它恶性血液病、如经典型霍奇金淋巴瘤(chl)、原发性纵膈大b细胞淋巴瘤、t细胞/组织细胞的富b细胞淋巴瘤、ebv阳性和阴性ptld和ebv相关弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、浆母细胞性淋巴瘤、结外nk/t细胞淋巴瘤、鼻咽癌和hhv8相关原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(cns)肿瘤，例如原发性cns淋巴瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。

45、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

46、在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。

47、在一方面，本技术还提供了如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段、或如前所述的缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测肿瘤是否能够通过靶向pd-l1的抗肿瘤疗法来治疗。

48、(1)将含有所述肿瘤细胞的样品与如前所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如前所述的缀合物接触；

49、(2)检测所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述的缀合物与pd-l1之间复合物的形成。

50、在某些实施方案中，所述肿瘤表达pd-l1蛋白(即pd-l1阳性)。

51、在某些实施方案中，所述肿瘤涉及pd-l1的肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述pd-l1在所述肿瘤细胞表面上表达。

52、在某些实施方案中，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿(mycosis fungoids)、默克尔细胞癌和其它恶性血液病、如经典型霍奇金淋巴瘤(chl)、原发性纵膈大b细胞淋巴瘤、t细胞/组织细胞的富b细胞淋巴瘤、ebv阳性和阴性ptld和ebv相关弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、浆母细胞性淋巴瘤、结外nk/t细胞淋巴瘤、鼻咽癌和hhv8相关原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(cns)肿瘤，例如原发性cns淋巴瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。

53、检测方法

54、在一方面，本技术还提供了用于检测pd-l1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物。

55、在某些实施方案中，所述方法用于治疗目的，诊断目的，或者非治疗非诊断目的。

56、在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

57、在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的缀合物。

58、在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述纳米抗体或其抗原结合片段。

59、在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在pd-l1。

60、术语定义

61、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

62、当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

63、除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。

64、如本文中所使用的，术语“纳米抗体”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的结构。纳米抗体可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体，两者可互换使用。

65、如本文中所使用的，术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamental immunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，raven press,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

66、可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。

67、在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。

68、如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabat et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature 342:878-883)或imgt编号系统(lefranc et al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefranc et al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。在本文中，纳米抗体的cdr优选地通过imgt编号系统确定。

69、如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。

70、如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。

71、两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是karlin和altschul的算法，1990,proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:2264-2268，如同karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403的nblast和xblast程序中。

72、如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

73、两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvist m,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annual rev biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。

74、如本文中所使用的，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。

75、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

76、如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。

77、如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人protein eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.set usa 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

78、本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2nd edition,e.s.golub and d.r.gren,eds.,sinauer associates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。

79、发明的有益效果

80、本技术提供的抗pd-l1的单克隆纳米抗体，对pd-l1分子具有良好的亲和力和阻断pd-l1/pd-1结合的活性。特别的，所述pd-l1纳米抗体能够特异的结合细胞表面的pd-l1分子；在表达人源pd-l1的小鼠肿瘤模型中，该pd-l1纳米抗体能够显著抑制肿瘤的生长，并对小鼠具有良好的生物安全性。因此，本发明的抗pd-l1的纳米抗体在肿瘤的靶向治疗及诊断领域具有巨大的潜力，可用于与多种目的，例如作为肿瘤的治疗药物、诊断试剂等。

81、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

技术特征：

1.特异性结合pd-l1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

2.权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的氨基酸序列：

3.权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含驼源重链抗体的框架区或源自人免疫球蛋白的重链框架区；

4.双特异性或多特异性抗体，其包含权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段；

5.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段。

6.载体，其包含权利要求5所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。

7.宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。

8.制备权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段。

9.缀合物，其包含权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体，以及偶联部分；

10.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求5所述的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求9所述的缀合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。

11.一种抑制表达pd-l1的肿瘤细胞生长和/或杀伤所述肿瘤细胞的方法，其包括将所述肿瘤细胞与有效量的权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求5的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求9所述的缀合物、或权利要求10所述的药物组合物接触。

12.权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求5的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求9所述的缀合物、或权利要求10所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗肿瘤；

13.用于检测pd-l1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-3任一项的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述的缀合物；优选地，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

14.权利要求1-3任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述的缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测肿瘤是否能够通过靶向pd-l1的抗肿瘤疗法来治疗；

技术总结
本发明涉及免疫学及肿瘤学领域，具体而言涉及抗PD‑L1的纳米抗体或其抗原结合片段，编码所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸分子及包含其的宿主细胞。本发明还涉及包含所述纳米抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体、缀合物和药物组合物，以及它们在治疗肿瘤中的用途。

技术研发人员：黄承浩,林超龙,罗文新,陈远志,娄瑞,敖正宏,黄小旋,张军,夏宁邵
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23