一种超快速实时定量PCR方法及其应用与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种超快速实时定量pcr方法及其应用。

背景技术：

1、实时荧光定量pcr技术(quantitative real-time pcr，rt-pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点是能将微量的dna大幅增加。该技术通过在pcr反应体系中加入荧光标记的探针(如taqman)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增反应过程。传统的pcr反应过程中主要包括三个步骤，即变性、退火、延伸。变性是指dna双链在体外95℃高温时变性解开成单链；退火是指在低温(通常是60℃左右)引物与变性解链的单链按碱基互补配对的原则结合，重新形成dna双链结构；延伸是指将温度调至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。而在rt-pcr中，由于通常检测的目的片段长度一般较短，因此在反应过程中也经常采用两步法扩增，即95℃变性，60℃退火/延伸。但是这种常规两步法扩增一般用时在60min-120min，耗时长，难以满足大批量快速检测的需求。为提高实际工作中的检测效率，亟需一种快速的pcr扩增检测方法满足市场需求。

2、目前，为实现核酸快速检测的需求，已有相关研究从pcr检测步骤着手，通过降低pcr过程中的变性温度和提高退火温度，缩短变性和退火的温度差，从而减少检测的总时长。如专利cn111944881a中提到通过对上下游引物、荧光探针的优化设计，提高引物探针的tm值，大幅提高了扩增过程中退火/延伸步骤温度，缩小了变性与退火/延伸过程的温度差，从而减少了升温、降温过程中所需的时间，以达到缩短核酸扩增反应时间的目的。再如专利cn110804652a中提到通过使用添加剂二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、tween-20、海藻糖降低引物探针tm值，同时通过引物探针序列设计控制tm值，降低pcr变性和退火之间温度差，缩短pcr扩增时间。虽然之前研究可以通过增加引物探针tm值来缩短pcr变性和退火之间温度差，减少pcr所需时间，同时也可以增加pcr添加剂降低相关引物探针tm值，但是在实际的pcr多重检测应用中，由于检测靶标序列的多样性，扩增子gc(at)含量各异，这时若要平衡各靶标引物探针tm值，使各个靶标间不会因tm值差异过大而导致扩增效率的明显偏差，引物探针设计难度较大，导致以上应用领域受限。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种超快速实时定量pcr方法，其特征在于提供一种缩短pcr变性和退火/延伸的温度差的超快速扩增程序，为实现这种快速扩增程序需优选扩增子gc含量，提高引物探针tm值，使用pcr添加剂优化引物探针tm值，使之更适合超快速扩增程序。

2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种超快速实时定量pcr方法，所述方法为：优选扩增子gc含量，同时提高引物探针tm值，并加入添加剂，从而缩短pcr变性和退火延伸的温度差，减少每轮pcr扩增所需要的时间，实现对目标序列的快速扩增，所述快速扩增程序的每个循环为：88-95℃变性1-2s；65-70℃退火延伸5-10s；扩增子gc含量＜62％时，加入添加剂盐酸胍或者盐酸胍和peg、tween20的组合；扩增子gc含量≥62％时，加入添加剂甲酰胺和/或甜菜碱。

4、作为优选实施方式，通过优选扩增子gc含量，同时提高引物探针tm值，并加入添加剂，缩短pcr变性和退火延伸的温度差。

5、作为优选实施方式，所述扩增子gc含量为≤60％，扩增子长度60bp-200bp。

6、作为优选实施方式，所述pcr方法中对引物探针的设计需满足条件：引物tm值为65℃-70℃，探针tm值为75℃-80℃(可使用锁核酸lna修饰探针，从而提高探针tm值)，引物探针的长度为13-40bp。

7、作为优选实施方式，所述快速扩增程序为：

8、预变性：95℃2s-30s 1个循环；

9、主循环(变性/退火延伸)：88℃-95℃1-2s，65℃-70℃5-10s，35-40个循环。

10、作为优选实施方式，所述快速扩增程序在主循环之前还包括预循环(可选，根据引物探针tm值决定是否需要预循环)：95℃1-5s，62℃-65℃8-15s 5个循环。

11、作为优选实施方式，当检测的目标片段为rna时，所述快速扩增程序在预变性之前还包括逆转录：55℃2min-5min 1个循环。

12、作为优选实施方式，所述主循环(变性/退火延伸)为：90℃-95℃1s，68-70℃8s，40个循环。

13、作为优选实施方式，所述添加剂在pcr反应体系中的浓度为：盐酸胍10mm-70mm，peg质量体积比为0.5％-5％(表示100ml溶液中含0.5-5g peg)，tween20体积百分比0.01％-2％，甲酰胺体积百分比为0.5％-2％或甜菜碱100-500mm。

14、作为优选实施方式，所述添加剂在pcr反应体系中的浓度为：盐酸胍20-50mm，peg质量体积比1-2％，tween20体积百分比0.04-0.05％，甲酰胺体积百分比为0.8-1％或甜菜碱150-200mm。

15、作为优选实施方式，所述添加剂在pcr反应体系中的浓度为：盐酸胍50mm，peg质量体积比为2％，tween20体积百分比0.05％，甲酰胺体积百分比为1％或甜菜碱200mm。

16、本发明还提供一种实时定量pcr的试剂盒，包含上述的超快速实时定量pcr方法中采用的试剂。

17、本发明还提供上述试剂盒在呼吸道病原体核酸多重检测试剂中的应用。

18、作为优选实施方式，所述呼吸道病原体应用包括但不限于副流感1、副流感2、副流感3、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、新型冠状病毒、甲型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒(hku1/oc43/nl63/229e)或肺炎衣原体。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

20、1.已有的pcr快速扩增程序或者pcr快速扩增方法，由于未考虑到实际扩增中靶标序列各异，扩增子gc含量变化较大，特别是对于不同gc含量的多重扩增体系的情况，导致其应用范围受限。本发明提供一种适用范围更为广泛的pcr超快速扩增方法，针对各种检测靶标，均可使用的pcr扩增程序和对应解决方法。

21、2.本发明提供了一种缩短pcr变性和退火/延伸的温度差的超快速扩增程序，为实现这种快速扩增程序需优选扩增子gc含量，提高引物探针tm值，使用pcr添加剂优化引物探针tm值，本发明研究发现添加剂盐酸胍、peg、tween20可明显提高低gc含量扩增子的引物探针tm值，使之适应超快速扩增程序；同时又可以提高常规gc含量(50％-60％)扩增子靶标的扩增效率。对于高gc扩增子(gc含量≥62％)，另外添加甲酰胺，甜菜碱，用来降低变性所需温度。

22、3.相对于其它pcr检测，本发明退火/延伸时间缩短(采集荧光)为5-10秒，大大减少了pcr扩增时间。一般情况下20min-30min完成pcr扩增检测，最快19min完成扩增。

技术特征：

1.一种超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述方法为：根据扩增子gc含量加入添加剂，缩短pcr变性和退火延伸的温度差，实现对目标序列的快速扩增，所述快速扩增程序的每个循环为：88℃-95℃变性1-2s；65-70℃退火延伸5-10s；扩增子gc含量＜62％时，加入添加剂盐酸胍或者盐酸胍和peg、tween20的组合；扩增子gc含量≥62％时，加入添加剂甲酰胺和/或甜菜碱。

2.根据权利要求1所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于：通过优选扩增子gc含量，同时提高引物探针tm值，并加入添加剂，缩短pcr变性和退火延伸的温度差。

3.根据权利要求2所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于：所述优选扩增子gc含量为≤60％，扩增子长度60bp-200bp。

4.根据权利要求2所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于：所述引物探针需满足条件：引物tm值为65℃-70℃，探针tm值为75℃-80℃，引物探针的长度为13-40bp。

5.根据权利要求1所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述快速扩增程序为：

6.根据权利要求5所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述快速扩增程序在主循环之前还包括预循环：

7.根据权利要求5所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，当检测的目标片段为rna时，所述快速扩增程序在预变性步骤之前还包括：

8.根据权利要求5所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述主循环为：变性90℃-95℃1s；退火/延伸68℃-70℃8s，40个循环。

9.根据权利要求1所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述添加剂在pcr反应体系中的浓度为：盐酸胍10mm-70mm，peg质量体积比0.5％-5％，tween20体积百分比0.01％-2％，甲酰胺体积百分比为0.5％-2％或甜菜碱100-500mm。

10.根据权利要求1所述的超快速实时定量pcr方法，其特征在于，所述添加剂选自浓度为盐酸胍20-50mm，peg质量体积比1-2％，tween20体积百分比0.04-0.05％，甲酰胺体积百分比为0.8-1％或甜菜碱150-200mm。

11.一种实时定量pcr的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的超快速实时定量pcr方法中采用的试剂。

12.权利要求11所述的试剂盒在呼吸道病原体核酸多重检测试剂中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述呼吸道病原体包括：副流感1、副流感2、副流感3、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、新型冠状病毒、甲型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒或肺炎衣原体中的一种或多种。

技术总结
本发明提供一种超快速实时定量PCR方法。所述方法为：优选扩增子GC含量，同时提高引物探针Tm值，并加入添加剂，从而缩短PCR变性和退火/延伸的温度差，减少每轮PCR扩增所需要的时间，实现对目标序列的快速扩增，所述快速扩增程序的每个循环为：88℃‑95℃变性1‑2s；65‑70℃退火/延伸5‑10s；扩增子GC含量＜62％时，加入添加剂盐酸胍或者盐酸胍和PEG、TWEEN20的组合；扩增子GC含量≥62％时，加入添加剂甲酰胺和/或甜菜碱。本发明提供一种缩短PCR变性和退火/延伸的温度差的超快速扩增程序，为实现这种快速扩增程序需优选扩增子GC含量，提高引物探针Tm值，使用PCR添加剂提高扩增子解链速率以及引物探针结合效率，使之更适合超快速扩增程序。

技术研发人员：左红伟,严俊,张琳,李彪,李庆伟,杜赞花,罗承梅,储丽娜,欧阳学良,严江燕,童慧娟,巫益鸣,陈才夫,熊磊
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23