一种Notum的生物发光底物及其应用

本发明属于医药，具体涉及一种用于检测notum水解活性的生物发光检测法及其应用，同时也包括构建该方法的生物发光底物及其制备方法。

背景技术：

1、wnt/β-catenin信号通路是在后生动物中高度保守的信号通路，它调控包括胚胎发生、突触发生、发育和组织稳态在内的多种生物学过程。wnt信号水平的异常与许多人类疾病(如阿尔茨海默病、发育缺陷和各种类型的癌症)密切相关，故wnt信号通路的平衡至关重要。在所有已报道的wnt信号通路调控因子中，人棕榈酰蛋白羧酸酯酶notum以其安全性与特异性在近十年来备受关注。notum作为丝氨酸水解酶家族的关键成员，在胞外催化成熟wnt蛋白上棕榈油酰基的水解进而使其失活，是生物体内wnt信号通路的重要负反馈调节因子。notum在原发性肝细胞癌和结直肠癌中过表达，成人v-svz中正常神经发生的维持也与notum密切相关。notum抑制剂疗法已被证实为治疗各种人类疾病的新兴策略，包括治疗结直肠癌，预防肥胖和糖尿病，预防非椎体骨折以及恢复肠干细胞活力等，此外notum激动剂还可用于抑制hbv诱导的肝纤维化。

2、越来越多的疾病被证明与notum相关，但现有的notum探针不足以用于进一步的病理研究和新药研发，迫切需要性能更为优越的分子工具。以往的notum活性检测与抑制剂筛选方法主要采用8-辛酰氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(opts)作为生物发光底物进行评价，但opts可被死亡细胞释放的其他酶水解，仅可用于单酶层面上的活性评价；较差的选择性和无法进行生物成像的缺陷同样限制了如abc99等活性蛋白质表达谱(activity-basedprotein profiling，abpp)方法在notum活性检测中的应用。上述分子工具在细胞及以上水平缺乏高选择性和适用性，新型notum探针的设计必须引入新的策略来解决这些问题。生物发光报告基团d-萤光素(d-luciferin)被认为是一种应用前景很广的生物成像工具，具有很高的生物相容性与令人满意的量子产率，与典型的化学发光相比因其特殊的发光机制使其信号不受外部光源的干扰，背景底噪小，分辨率高，且不会对样品造成光损伤。根据notum对辛酸酯的底物偏好性，我们构建了萤光素辛酸酯(octanoyl luciferin,ol)作为notum的生物发光底物并构建了相应的notum活性检测方法，该方法在重组notum、商品化细胞/组织制备物、细胞上清液/其他生物流体等产品中均能定量检测notum的活性，具有操作简便、灵敏度高、抗干扰性强、特异性好等优点。萤光素辛酸酯填补了活细胞、细胞外基质和组织制剂中notum水平精确成像与定量检测的空白；良好的抗干扰性能使其应用前景比现有的分子工具更为广阔。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测notum活性的生物发光底物及其制备方法和应用，该方法和应用主要解决现有技术中notum活性检测方法选择性差及无法在细胞及以上层面的复杂生理/仿生条件下进行检测与成像的技术问题。

2、本发明提供了一种人棕榈酰蛋白水解酶notum(hnotum)的特异性生物发光底物，其结构如式(1)所示：

3、

4、本发明还提供了萤光素辛酸酯的制备方法，以2-氰基-6-羟基-苯并噻唑为原料，经由辛酸-(2-氰基苯并噻唑-6-氧)酯作为中间产物的两步反应获得萤光素辛酸酯。

5、本发明还提供了萤光素辛酸酯底物在检测生物样本/仿生样本中notum的活性或残余活性中的用途。

6、进一步的，萤光素辛酸酯底物被notum特异性催化裂解并产生等量的d-萤光素产物，通过检测生物发光的发光强度来定量检测生物样本中notum的活性或残余活性。

7、进一步的，萤光素辛酸酯本身不发光，其被notum催化后产生的d-萤光素在萤光素酶的氧化作用下发生生物发光反应生成氧化萤光素并发出557nm的可见光。由于相同反应条件下d-萤光素被萤火虫萤光素酶氧化后发出的生物发光信号强度与notum水解萤光素辛酸酯底物所生成的d-萤光素的生成量成正比关系，故通过测定规定生物发光反应时间(5-20分钟)内生物发光反应的发光强度即可获得notum水解反应中所生成的底物d-萤光素的生成量，从而定量检测生物样本中notum的活性或残余活性。

8、由于该生物发光反应不需要外来光源的激发，故背景底噪小，利用发光强度即可测定单位时间内d-萤光素的生成量。

9、本发明还提供了一种检测生物样本中notum活性的方法，将待测样品和萤光素辛酸酯底物混合后起始反应；孵育10分钟后借助荧光检测设备检测生物发光的强度进而定量评估生物样本中notum的活性。

10、进一步的，所述待测样品包括但不限于notum重组单酶、表达notum的各类细胞或细胞制备物、过表达notum的工程细胞或其制备物，细胞上清液或其他生物流体，或者商品化的组织制备物。

11、本发明还提供了一种notum调控剂的筛选和评价方法，采用萤光素辛酸酯底物用于测定任意待测化合物对notum活性的调控作用(包括抑制、激活、灭活和诱导作用)。

12、进一步的，以萤光素辛酸酯为探针底物，在生理条件下将含有notum的生物样品和待评价化合物混合后温孵3分钟，然后加入萤光素辛酸酯起始反应；孵育10分钟后终止反应，利用生物发光强度测定底物单位时间内生成d-萤光素的速率并与无待评价化合物组的生成速率进行比较，获得待评价化合物对notum的调控能力。

13、进一步的，所述含有notum的生物样品可选择notum重组单酶、表达notum的各类细胞或细胞制备物、过表达notum的工程细胞或其制备物，细胞上清液或其他生物流体，或者商品化的组织制备物。

14、所述待评价化合物为：notum的调控剂，测的是调控剂对notum的调控能力(抑制、激活、灭活和诱导作用)。萤光素辛酸酯底物经过酶(不同来源的notum)的代谢产生等量的d-萤光素，d-萤光素被萤光素酶氧化从而发光。利用生物发光强度测定萤光素辛酸酯底物在单位时间内反应生成d-萤光素的速率并与无待评价化合物组的d-萤光素生成速率比较，获得待评价化合物(调控剂)对notum的调控能力。

15、本发明的底物萤光素辛酸酯作为notum的特异性底物可被notum特异性裂解为等量的d-萤光素，通过生物发光机制发射一定波长的可见光，利用生物发光定量检测单位时间内d-萤光素的生成量来测定不同酶源中notum的活性。

16、本发明可通过评估重组notum酶、商品化细胞/组织制备物等生物产品中notum的活性进而对上述产品进行质控。

17、本发明还可测定任意待测化合物对重组hnotum酶、细胞上清液/生物流体、商品化细胞/组织制备物等生物产品中hnotum活性的调控作用(包括抑制、激活、灭活和诱导作用)，所述生物产品包括但不限于hnotum重组单酶、表达hnotum的各类细胞或细胞制备物、过表达hnotum的工程细胞或其制备物，细胞上清液或其他生物流体，以及商品化的组织制备物。

18、本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。选用本发明所述hnotum特异性生物发光底物检测hnotum酶活性具有以下优势：

19、(1)特异性好：萤光素辛酸酯可被hnotum高特异性地代谢并生成等量的d-萤光素产物，可用于细胞及以上水平的人棕榈酰蛋白酯酶notum活性检测。

20、(2)亲和力高：萤光素辛酸酯底物与hnotum具有高亲和力，km小于5微摩。

21、(3)产物易于检测且无光损伤：萤光素辛酸酯底物的d-萤光素产物在萤光素酶与atp的存在下即可发光，在557nm具有很强的生物发光信号，可借助配有光检测器的任意设备检测。由于其特殊的发光机制，该检测方法不会对待测样品造成光损伤。

22、(4)检测通量高：利用萤光素辛酸酯底物建立的抑制剂筛选方法可实现96、384孔板的高效快速实时检测。

23、(5)可为待测化合物提供更为准确的抑制作用评价：利用萤光素辛酸酯在细胞上清液中进行的hnotum抑制剂筛选方法考虑了生理条件对化合物抑制作用的影响，相比于在重组hnotum溶液中的抑制剂筛选方法能够提供更为准确的抑制作用评价。

技术特征：

1.一种用于检测人棕榈酰蛋白水解酶notum的生物发光底物，其特征在于：其为萤光素辛酸酯，结构式如式(1)所示：

2.一种权利要求1所述的生物发光底物的制备方法，其特征在于：以2-氰基-6-羟基-苯并噻唑为原料，在二氯甲烷中与辛酰氯常温搅拌生成辛酸-(2-氰基苯并噻唑-6-氧)酯粗品，经分离纯化后获得辛酸-(2-氰基苯并噻唑-6-氧)酯；将辛酸-(2-氰基苯并噻唑-6-氧)酯与d-半胱氨酸和无水碳酸钾溶于甲醇/二氯甲烷/水混合溶液中，在氮气氛围中室温搅拌获得萤光素辛酸酯粗品，经分离纯化后获得萤光素辛酸酯。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.一种权利要求1所述的生物发光底物在检测生物样本中notum的活性或残余活性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的notum生物发光底物萤光素辛酸酯在生理条件下自身并不发光，其被notum特异性催化裂解酯键并释放出等摩尔量的d-萤光素，在萤火虫萤光素酶(luciferase)的作用下d-萤光素被催化氧化发生生物发光反应生成氧化萤光素并发出生物发光信号，其发射波长在557nm；通过测定规定生物发光反应时间(5-20分钟)内生物发光反应的发光强度即可获得notum水解反应中所生成的d-萤光素的生成量，从而定量检测生物样本中notum的活性或残余活性。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：采用权利要求1所述notum的生物发光底物萤光素辛酸酯，在生理条件下将待测生物样本和notum的生物发光底物萤光素辛酸酯混合后孵育10分钟，终止反应并加入萤火虫萤光素酶制剂(promega biotech,usa)，借助荧光检测设备检测所生成的d-萤光素在5-20分钟内被萤火虫萤光素酶氧化而发出的生物发光信号进而定量评估生物样本中notum的活性。

7.根据权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于：所述待测生物样本包括但不限于重组notum酶、表达notum的各类细胞或细胞制备物、过表达notum的工程细胞或其制备物，细胞上清液、商品化的组织制备物或其它含notum的生物样本。

8.一种notum调控剂的筛选和评价方法，其特征在于：采用权利要求1所述notum的生物发光底物萤光素辛酸酯用于测定任意待测化合物对notum活性的调控作用。

9.根据权利要求9所述的notum调控剂的筛选和评价方法，其特征在于：以权利要求1所述notum的生物发光底物萤光素辛酸酯为探针底物，在生理条件下将含有notum的生物样品和待评价化合物混合后温孵3分钟，然后加入探针底物起始反应，孵育10分钟后冰浴终止反应；加入萤火虫萤光素酶制剂，测定所生成的d-萤光素在5-20分钟内被萤火虫萤光素酶氧化而发出的生物发光信号并与无抑制剂组的生物发光信号进行比较，获得待评价化合物对notum的调控能力。

10.根据权利要求9所述的一种notum调控剂的筛选和评价方法，其特征在于：所述含有notum的生物样品可为重组notum酶、表达notum的各类细胞或细胞制备物、过表达notum的工程细胞或其制备物、细胞上清液、商品化的组织制备物、其它含notum的生物样本中的任意一种。

技术总结
本发明涉及一种人棕榈酰蛋白水解酶Notum的生化检测方法及其应用。本发明开发了一种Notum的特异性生物发光底物(萤光素辛酸酯)，其在生理条件下可被Notum特异性催化发生水解后释放出萤光素；后者在萤火虫萤光素酶的作用下被催化氧化成氧化萤光素从而发出可见光，利用发光强度可测定单位时间内反应所生成的D‑萤光素进而定量检测生物样本中Notum的活性或残余活性。借助该生物发光底物构建的Notum活性检测方法可用于定量分析重组表达的Notum酶、细胞/商品化组织制备物、细胞上清液/其它生物样品中Notum的活性；同时还可用于筛选和评价化合物对Notum酶的调控作用。

技术研发人员：尹恒,葛广波,宋荔琳,孙梦茹,石金徽
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23