一种检测黄曲霉素B1的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种黄曲霉素单链抗体和包含所述抗体的粮油检测试剂盒，尤其涉及一种检测黄曲霉素的胶体金免疫试剂盒。

背景技术：

1、黄曲霉毒素（aft）全称为黄曲霉毒素，是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素。至今，已经分离鉴定出黄曲霉素及其衍生物共约20种，分别命名为b1、b2、g1、g2、m1、m2、gm、p1、q1、毒醇等。黄曲霉素具有致突变性，能使人成纤维细胞发生程序外dna合成，动物实验可见染色体畸变，染色体断裂，某些染色体4q、13q、14p发生缺失。黄曲霉素是我们目前所知的最强生物致癌剂，早在1993年，它就被世界卫生组织的癌症研究机构划定为ⅰ类致癌物，1毫克就足以达到致癌剂量，是一种毒性极强的剧毒物质。

2、黄曲霉素具有致突变性，能使人成纤维细胞发生程序外dna合成，动物实验可见染色体畸变，染色体断裂，某些染色体4q、13q、14p发生缺失。黄曲霉素是我们目前所知的最强生物致癌剂，早在1993年，它就被世界卫生组织的癌症研究机构划定为ⅰ类致癌物，1毫克就足以达到致癌剂量，是一种毒性极强的剧毒物质。

3、黄曲霉素引起人的中毒主要是损害肝脏，摄入大剂量的黄曲霉毒素后可出现肝实质细胞坏死、胆管上皮细胞增生、肝脂肪浸润及肝出血等急性病变，前期症状为发烧、呕吐、厌食、黄疸，继而出现腹水，下肢浮肿并很快死亡。它可致发生肝癌，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症。

4、在已分离鉴定的黄曲霉素中，以黄曲霉素b1（afb1）的毒性最大，致癌性最强。动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后，在肝、肾、肌肉、血、奶及蛋中可测出极微量的毒素。

5、黄曲霉素常常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、食用油等制品中也经常发现黄曲霉素。在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉素的检出率比较高。在中国总的分布情况为：华中、华南、华北产毒株多，产毒量也大，东北、西北地区较少。

6、正是因为黄曲霉素的毒性，目前世界上有70多个国家制订了食品和饲料中黄曲霉毒素的最高限量标准和相应的法规。我国也于1990年11月26日颁布了《防止黄曲霉毒素污染食品卫生管理办法》。办法中规定，不同类样本中黄曲霉素b1的限量为5-204μg/kg。

7、黄曲霉素的定量测定方法主要包括理化分析方法（色谱分析）和免疫化学法（如elisa法、胶体金免疫层析法等）。免疫化学法由于其快速、低成本、适合大量样本的高通量检测等特点被越来越广泛的应用于黄曲霉毒素分析检测领域。免疫化学法中均需使用黄曲霉素抗体，黄曲霉素抗体决定了检测方法的灵敏度。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种黄曲霉素b1单链抗体及其在制备检测黄曲霉毒素中的应用。

2、本发明提供的黄曲霉素b1单链抗体包括抗体轻链可变区、重链可变区和连接肽，并通过连接肽将轻链可变区和重链可变区连接成为单链抗体。

3、本申请发明人在前期研究中获得一种黄曲霉素b1单链抗体afb1-hq1，其序列如seq id no:1所示，其中第1-110位为轻链可变区，第111-140位为（ggggs）6柔性连接肽，第141-258位为重链可变区。afb1-hq1能够特异性识别黄曲霉素b1，检测黄曲霉b1的灵敏度可以达到0.136ng/ml（ic50）。

4、在前期研究中，本申请发明人通过将黄曲霉素b1人工抗原免疫balb/c小鼠，并制备获得稳定分泌黄曲霉素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。从所述杂交瘤细胞株中，筛选出目标单克隆抗体，测序得到单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区，并通过柔性链将两者连接为单链抗体afb1-hq1。

5、为了进一步获得检测灵敏度更高的黄曲霉素b1单链抗体，并用于制备检测灵敏度更高、品质更优的免疫检测产品，本申请发明人利用单链抗体空间结构模拟软件，对黄曲霉素b1单链抗体afb1-hq1进行进一步优化设计，经过大量的模拟计算和实验证实，最终获得包括多个突变位置组合的突变单链抗体afb1-hq2，突变后的单链抗体afb1-hq2具备显著提高的检测灵敏度，对黄曲霉素b1（afb1）的检测灵敏度提高数倍，检测黄曲霉b1的灵敏度可以达到0.027ng/ml（ic50）。

6、因此，本发明第一方面，提供一种黄曲霉素b1单链抗体，所述单链抗体通过连接肽将抗体轻链可变区和重链可变区连接而成。

7、进一步的，本发明所述单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第1-110位所示；所示重链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第141-258位所示。

8、进一步地，本发明所述单链抗体的连接肽为柔性连接肽，所述柔性连接肽为（ggggs）n，其中n为3-8；优选为（ggggs）6。

9、所述抗体的氨基酸序列如seq id no:2所示，其中第1-110位为轻链可变区，第111-140位为（ggggs）6柔性连接肽，第141-258位为重链可变区。

10、另一方面，本发明提供一种编码上述单链抗体的核苷酸片段。

11、另一方面，本发明提供一种检测黄曲霉素b1的免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含上述单链抗体afb1-hq2。

12、进一步地，本发明的试剂盒为elisa试剂盒。

13、另一方面，本发明提供一种黄曲霉素b1单链抗体afb1-hq2在制备检测黄曲霉b1的免疫检测试剂盒中的应用；优选地，所述试剂盒为elisa试剂盒。

14、本发明提供的黄曲霉素b1单链抗体及其检测试剂盒，具备较高检测高灵敏度，适用于粮油产品等的快速免疫检测。

技术特征：

1.一种检测黄曲霉素b1的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一种黄曲霉素b1单链抗体，所述单链抗体通过连接肽将抗体轻链可变区和重链可变区连接而成；所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第1-110位所示；所述重链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第141-258位所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试剂盒，所述试剂盒为elisa试剂盒。

4.一种黄曲霉素b1单链抗体，所述单链抗体通过连接肽将抗体轻链可变区和重链可变区连接而成；所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第1-110位所示；所述重链可变区氨基酸序列如seq id no:2中第141-258位所示。

5.根据权利要求4所述的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的连接肽为柔性连接肽，所述柔性连接肽为（ggggs）n，其中n为3-8。

6.根据权利要求5所述的单链抗体，其特征在于，所述连接肽为（ggggs）6。

7.根据权利要求6所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

8.编码权利要求4-7任一项所述单链抗体的核苷酸片段。

9.权利要求4-7任一项所述的单链抗体在制备检测黄曲霉b1的免疫检测试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为elisa试剂盒。

技术总结
本发明涉及一种黄曲霉素B1检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包含一种黄曲霉素B1单链抗体。本发明的单链抗体由柔性连接肽连接轻链可变区与重链可变区而成，并经过优化设计，具有显著提高的检测灵敏度。应用本发明的单链抗体的试剂盒能够便捷、快速、准确的检测粮油等产品中的黄曲霉素B1。

技术研发人员：霍岩,霍宗光
受保护的技术使用者：霍岩
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23