一种用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法及应用
本发明涉及一种用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法及应用，属于生物医药领域。
背景技术：
1、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)具有病情复杂迁延、难以痊愈、病变部位易发生癌变等特点，被世界卫生组织认定为现代难治疾病之一，全球发病率逐年增加。目前传统治疗方法主要以外科手术和药物治疗为主，然而两种治疗方式目前都各自有着不可避免的局限性，治疗效果并不令人满意且存在诸多弊端。虽然免疫抑制剂、生物制剂、微生态制剂等新型治疗方法接连被研发，仍会因生物利用度低、成本高等问题致临床应用受限。因此寻求针对uc的新的更安全有效，可长期使用的预防或治疗方法是一个亟待解决的问题。
2、l-谷氨酰胺(l-gln)是一种“条件性必需”氨基酸，肠道上皮细胞的首要能源物质，长期以来的研究表明，其是一种在各种损伤或应激条件下保持肠道功能，结构完整性并促进肠道重建及恢复的药物。越来越多的证据表明，gln是一种关键的“药理作用营养素”，显示出对肠道、肠外组织和整个机体的治疗益处。gln有潜力成为ibd首个临床相关的热休克反应增强剂，这可能是改善ibd患者疗效的关键。若直接进行口服，会快速被胃肠吸收，表观分布容积较大，难以在疾病部位发挥功效。
3、牛奶源性外泌体中含有大量mirna和蛋白质等小分子，与炎症反应的调节作用息息相关，对溃疡性结肠炎部位细胞增殖和肠屏障修复起着重要作用。牛奶源性外泌体不仅有安全、半衰期长、易于获取、低免疫原性及高生物相容性等特点，是天然的载药脂质体；还具有抗炎、抗氧化、调节免疫与肠道菌群及促进粘膜修复等作用，且口服后具有稳定性、有效性和高渗透性，是潜在预防与治疗uc的天然外泌体。近年来，外泌体已经成为疾病治疗中药物和基因递送载体的理想候选。但其缺乏足够的靶向性，无法将药物特异递送到疾病部位。
技术实现思路
1、针对上述现有技术存在的不足与缺陷，本发明提供了一种负载l-谷氨酰胺用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法及应用，目的在于解决l-谷氨酰胺和牛奶外泌体不能高效靶向炎症性肠病结肠炎的技术问题。
2、本发明提供的第一个技术方案是一种用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：
3、(1)l-谷氨酰胺装载：将l-谷氨酰胺溶于磷酸缓冲盐溶液，加入牛奶外泌体溶液，混合均匀；然后在冰浴条件下，进行超声波处理后，孵育，离心，收集沉淀，得到负载l-谷氨酰胺的牛奶外泌体；
4、(2)6-姜烯酚靶向修饰：将步骤(1)制备的负载l-谷氨酰胺的牛奶外泌体和6-姜烯酚储备液分别溶解于磷酸缓冲盐溶液，再混合，离心，收集沉淀，干燥，即得用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒。
5、在某些实施方式中，将巴氏消毒牛奶通过等电点沉淀法和超高速离心法相结合提取所述牛奶外泌体。
6、进一步，提取所述牛奶外泌体的具体操作为：
7、s1，收集巴氏杀菌牛奶，以13,000×g离心30min，除去上层脂肪球和部分酪蛋白后，得到脱脂牛奶；
8、s2，然后用2mol/l的盐酸调节脱脂牛奶的ph至4.6(此ph为酪蛋白的等电点，在此ph条件下牛奶中的酪蛋白会析出)，沉淀酪蛋白后，以10,000×g离心60min，去除底部沉淀的酪蛋白后收集澄清溶液即为乳清，收集上清液；
9、s3，分别利用0.45μm和0.22μm注射式过滤器进一步除去乳清中残留的蛋白质后，以135,000×g离心60min，收集沉淀，将沉淀重悬于适量pbs中，135,000×g离心60min～70min，收集沉淀，即为牛奶外泌体。
10、进一步，所述离心均在4℃下进行。
11、在某些实施方式中，步骤(1)中，l-谷氨酰胺的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为400-600μg:1-1.5ml。
12、在某些实施方式中，步骤(1)中，l-谷氨酰胺与牛奶外泌体的质量比为1:(2-6)。
13、在某些实施方式中，步骤(1)中，利用超声波粉碎机进行超声波处理。
14、进一步，所述超声波粉碎机的条件设为：20％振幅，超声1min，开5s，关5s；进行超声循环6～10个周期，最优选超声6个周期，间隔2min。
15、在某些实施方式中，步骤(1)中，所述孵育的温度为37℃。
16、在某些实施方式中，步骤(1)中，所述离心的参数为：温度为4℃，135,000×g离心60min～70min。
17、在某些实施方式中，步骤(2)中，l-谷氨酰胺在磷酸缓冲液中的溶液终浓度为0.4～0.6mg/ml。
18、在某些实施方式中，步骤(2)中，6-姜烯酚的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为800～1000μg:1-1.5ml。
19、在某些实施方式中，步骤(2)中，牛奶外泌体与6-姜烯酚的质量比为(2～3):1。
20、在某些实施方式中，磷酸缓冲盐溶液的ph值为7.2～7.4。
21、在某些实施方式中，步骤(2)中，所述离心的参数为：温度为4℃，135,000×g离心60min～70min。
22、本发明提供的第二个技术方案是利用第一个技术方案所述方法制备得到的用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒。
23、本发明提供的第三个技术方案是包含第二个技术方案所述的牛奶外泌体纳米颗粒的药物或食品。
24、本发明提供的第四个技术方案是第一个技术方案所述的方法，或第二个技术方案所述的牛奶外泌体纳米颗粒在制备用于缓解和/或治疗炎症性结肠炎的药物中的应用。
25、本发明取得的有益效果：
26、本发明通过超声波处理，将l-谷氨酰胺载入牛奶外泌体膜结构中，可以保护其不被胃液消化吸收以及增加药物的缓释性。由于炎症部位中，nf-κb蛋白表达水平急剧增加，nf-κb作为炎症信号通路关键中心物质，进一步激活和加重炎症反应。6-姜烯酚可以与其特异性结合，本发明中的6-姜烯酚可通过靶向nf-κb结肠炎症给药，可将负载l-谷氨酰胺的牛奶源性外泌体递送至炎症结肠组织中，能够使其与靶向炎症细胞反应，从而释放外泌体中的l-谷氨酰胺，即获得了一种安全性高、稳定性好、具有持久抗炎性、靶向性较强的可用于治疗炎症性结肠炎的口服靶向nf-κb结肠炎症给药的负载l-谷氨酰胺的牛奶外泌体纳米颗粒。利用牛奶外泌体和l-谷氨酰胺抗炎、抗氧化及调节免疫的生物学活性，能够有效的促进炎症部位组织的再生和修复。
技术特征：
1.一种用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将巴氏消毒牛奶通过等电点沉淀法和超高速离心法相结合提取所述牛奶外泌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，l-谷氨酰胺的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为(400-600)μg:(1-1.5)ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，l-谷氨酰胺与牛奶外泌体的质量比为1:(2-6)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，l-谷氨酰胺在磷酸缓冲液中的溶液终浓度为0.4～0.6mg/ml；6-姜烯酚的质量与磷酸盐缓冲液的体积比为(800～1000)μg:(1-1.5)ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，牛奶外泌体与6-姜烯酚的质量比为(2-3):1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸缓冲盐溶液的ph值为7.2～7.4。
8.利用权利要求1～7任一项所述方法制备得到的用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒。
9.包含权利要求8所述的牛奶外泌体纳米颗粒的药物或食品。
10.权利要求1～7任一项所述的方法，或权利要求8所述的牛奶外泌体纳米颗粒在制备用于缓解和/或治疗炎症性结肠炎的药物中的应用。
技术总结
本发明公开了一种用于口服结肠炎症靶向的牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法及应用，属于生物医药领域。本发明提供的负载L‑谷氨酰胺的靶向牛奶外泌体纳米颗粒的制备方法，先通过超声装载L‑谷氨酰胺外泌体膜中，再通过搅拌进行靶向修饰，6‑姜烯酚亲电基团与带负电荷的牛奶外泌体发生离子反应，使其覆盖在外泌体膜表面，形成负载L‑谷氨酰胺的靶向牛奶外泌体纳米颗粒，该纳米颗粒具有较好的生物相容性，能够主动靶向到高表达NF‑κB蛋白的结肠炎症部位，使得负载L‑谷氨酰胺的靶向牛奶外泌体纳米颗粒中L‑谷氨酰胺特异性释放到炎症组织局域，进而发挥其抗炎和抗氧化作用，有效的促进炎症部位组织的再生和修复。
技术研发人员：成欣怡,邓超,孙青英,孙彦豪,梁子渊,李念,郑蕊
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23