具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物的制作方法
背景技术：
1、基于分离的抗原大分子(例如，第一代脑膜炎球菌、肺炎球菌和嗜血杆菌多糖疫苗)的疫苗代表了相较于基于减毒活疫苗或灭活生物体疫苗的早期疫苗调配物的显著改进。
2、纯化的大分子明显更易于制造、具有改进的安全特性并且可以产生更有效的特异性免疫应答(例如，纯化的大分子可以针对更加保守或对发病机制很重要的抗原)。此外，纯化的大分子为疫苗生产提供了简化的模板，其中免疫应答可以简单通过提供适当的免疫原而针对特定位点或特定生物体。然而，此策略受不便事实的影响-不是每个大分子都会产生强烈的免疫应答。许多脂质、多糖和某些蛋白抗原(和大多数小分子)产生在某些患者群体中固有地较弱、短暂和/或有缺陷的免疫应答(实例包含婴儿或老年人)。这些弱免疫应答被认为是由主要活化b细胞或以其它方式不能活化参与免疫记忆和抗体成熟的t细胞依赖性途径的抗原结构引起的。
技术实现思路
1、本公开涉及用于产生所公开的含有非天然氨基酸的免疫原性组合物的方法、组合物和技术。并入所述非天然氨基酸中的生物正交附着化学实现
2、针对免疫系统的更高效和更有力的抗原呈递、简化的纯化和这些半合成免疫原的更明确限定的结构。
3、在一个实施例中，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少一个非天然氨基酸或“nnaa”的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnaa缀合。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括来自蛋白质的至少一个t细胞活化表位，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)毒素、破伤风梭菌(clostridium tetani)破伤风痉挛毒素(也称为破伤风毒素)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)蛋白d(pd、hid)、血清组b脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(ompc)和crm197。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸。例如，所述载体蛋白包括crm197，其中天然crm197中的39个赖氨酸残基的至少2个赖氨酸残基(例如，至少3个、至少4个、至少5个、或至少6个)已经被nnaa所替换。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换所述天然载体蛋白中的苯丙氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa替换所述天然载体蛋白中的苯丙氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸和苯丙氨酸两者。在另一个实施例中，所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述载体蛋白与选自由以下组成的组的蛋白质具有至少80％的序列一致性：白喉毒素(dt)、破伤风毒素(tt)、流感嗜血杆菌蛋白d(pd)和crm197。在另一个实施例中，所述载体蛋白与seq id no:1具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，根据seq id no:1，所述至少一个t细胞活化表位来自crm197。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523或k527。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换seq id no:1的f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532。在另一个实施例中，所述至少两个nnaa替换seqid no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523、k527、f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k265。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k386。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k265和k386。在另一个实施例中，所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原经由三唑连接部分与所述nnaa缀合。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、流感嗜血杆菌(尤其是b型，即hib)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)或无乳链球菌(streptococcus agalactiae)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)的六种血清型中的一种血清型(例如，k1、k2、k3、k4、k5和/或k6)的荚膜多糖。
4、在一个相关实施例中，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，的载体蛋白，其中所述抗原与所述至少一个nnaa缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnaa是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
5、在另一个相关实施例中，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少一个nnaa残基，并且优选地至少两个nnaa残基，的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnaa缀合，并且进一步地，所述nnaa残基对应于具有式xii结构的氨基酸：
6、
7、其中：
8、ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
9、w5选自c1-c10亚烷基、-nh-、-o-和-s-；
10、q1为0或1；并且
11、w6选自叠氮基、任选地被低级烷基c-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基，
12、使得所述多肽中的所述nnaa残基具有式xiii结构：
13、
14、其中r3为oh或所述载体蛋白的氨基酸残基，并且r4为h或所述载体蛋白的氨基酸残基。
15、在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnaa，所述至少一个nnaa根据seq id no:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523或k527，其中所述nnaa包括连接部分。在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnaa，所述至少一个nnaa根据seq id no:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnaa替换seq id no:1的f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532，其中所述nnaa包括连接部分。在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnaa，所述至少一个nnaa根据seq id no:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnaa替换seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523、k527、f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532，其中所述nnaa包括连接部分。在另一个实施例中，所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，替换seq id no:1的k265。在另一个实施例中，替换seq id no:1的k386。在另一个实施例中，替换seq id no:1的k265和k386。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa。在另一个实施例中，所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。
16、在一个相关实施例中，所述多肽中的所述至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
17、在另一个相关实施例中，所述多肽中的所述至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，具有式xii结构：
18、
19、其中：
20、ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
21、w5选自c1-c10亚烷基、-nh-、-o-和-s-；
22、q1为0或1；并且
23、w6选自叠氮基、任选地被低级烷基c-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基。
24、在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括多肽-抗原缀合物，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少一个nnaa的载体蛋白，并且其中所述抗原与所述nnaa缀合。在另一个实施例中，所述多肽-抗原缀合物通过蛋白质-抗原-蛋白质连接交联。在另一个实施例中，所述组合物包括多种载剂-蛋白抗原缀合物，其中每种缀合物包括不同的抗原(例如，来自不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖)。在另一个实施例中，所述抗原源自相同生物体的不同血清型(例如，针对肺炎球菌)或血清组(例如，针对脑膜炎球菌)。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，hib)、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，k1、k2、k3、k4、k5和/或k6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f以及其任何组合。在另一个实施例中，所述组合物包括如本文所描述的蛋白质载剂-抗原缀合物，其中存在至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-荚膜多糖缀合物，每种缀合物包括选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的不同的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f。在另一个实施例中，所述多糖与所述载体蛋白的比率(w/w)大于1。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa。在另一个实施例中，所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述载体蛋白与选自以下的蛋白质具有至少80％的序列一致性：白喉毒素(dt)、破伤风毒素(tt)、嗜血杆菌蛋白d(pd)、血清组b脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(ompc)和crm197。在另一个实施例中，所述载体蛋白与crm197具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，所述载体蛋白与seq id no:1具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，载体蛋白与seq id no:1具有至少80％的序列一致性，进一步地，其中所述至少一个nnaa替换其中天然存在的氨基酸。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa替换选自由以下组成的组的氨基酸：seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523或k527。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，替换选自由以下组成的组的氨基酸：seq id no:1的f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532。在另一个实施例中，所述至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，替换选自由以下组成的组的氨基酸：seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523、k527、f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532。在另一个实施例中，所述抗原经由连接部分与所述nnaa缀合。在另一个实施例中，所述抗原经由三唑连接部分与所述nnaa缀合。
25、在一个相关实施例中，所述组合物中的所述多肽-抗原缀合物包括作为所述多肽的载体蛋白，所述载体蛋白包括至少一个t细胞活化表位和至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，其中所述抗原与所述nnaa缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnaa是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
26、在另一个相关实施例中，所述组合物中的所述多肽-抗原缀合物包括作为所述多肽的载体蛋白，所述载体蛋白包括至少一个t细胞活化表位和至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，其中所述抗原与所述nnaa缀合，并且进一步地，其中所述多肽中的所述至少一个nnaa具有式xii结构：
27、
28、其中：
29、ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
30、w5选自c1-c10亚烷基、-nh-、-o-和-s-；
31、q1为0或1；并且
32、w6选自叠氮基、任选地被低级烷基c-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基。
33、在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生缀合物的方法，所述方法包括：(a)提供活化的抗原，所述活化的抗原包括多个官能团，所述官能团包括能够与nnaa的第二化学柄(chemical handle)缀合的第一化学柄；(b)在所述第一化学柄和所述第二化学柄反应的条件下将所述活化的抗原与包括所述nnaa中的至少一个nnaa的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物，其中所述多肽包括至少一个t细胞活化表位；以及(c)回收包括所述缀合物的组合物。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，hib)、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，k1、k2、k3、k4、k5和/或k6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，在产生所述活化的抗原时，所述抗原与选自由cdap、cdi或高碘酸盐组成的组的第一试剂反应。在另一个实施例中，所述第一试剂小于1m高碘酸盐。在另一个实施例中，所述多个官能团包括羟基。在另一个实施例中，所述多个官能团包括醛基。在另一个实施例中，所述抗原与第二试剂反应，所述第二试剂包括选自由炔丙基、difo、dbco和dbco(peg)n-nh2组成的组的官能团。在另一个实施例中，所述抗原与包括dbco-nh2的第二试剂反应。在另一个实施例中，所述第一化学柄包括炔烃基团。在另一个实施例中，所述第二化学柄包括叠氮基。在另一个实施例中，所述组合物中的所述缀合物的所述抗原与所述多肽的比率(w/w)大于1。
34、在一个相关实施例中，所述用于产生缀合物的方法包括：(a)活化抗原以在其中并入至少一个第一化学柄，其中所述第一化学柄能够与所述多肽中的nnaa的第二化学柄缀合；(b)在所述第一化学柄和所述第二化学柄反应的条件下将所述活化的抗原与包括所述nnaa中的至少一个nnaa的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物，其中所述多肽包括至少一个t细胞活化表位；以及(c)回收包括所述缀合物的组合物。在此实施例的一方面，活化所述抗原包括将至少一个炔基并入所述抗原中作为所述第一化学柄。
35、在另一个相关实施例中，提供了一种用于产生多肽-抗原缀合物的方法，所述方法包括：通过在抗原中并入至少一个炔基作为第一化学柄来活化所述抗原；以及使所述抗原与包括至少一个nnaa，并且优选地至少两个nnaa，的多肽反应，所述nnaa带有作为第二化学柄的叠氮基，由此使非催化共价生物缀合反应能够在所述多肽与所述抗原之间进行。在优选的实施例中，限制所述炔基以增加例如环结构(如二芳基应变环辛炔)中的反应性。
36、在一个实施例中，本公开提供了一种在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法，所述方法包括在适于胃肠外给药的赋形剂中向所述受试者给予如本文所描述的缀合物。
37、在一个实施例中，本公开提供了一种在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法，所述方法包括在适于胃肠外给药的赋形剂中向所述受试者给予如本文所描述的组成物。
38、在一个实施例中，本公开提供了一种用于合成多肽的方法，所述多肽包括维持在约10摄氏度与约30摄氏度之间的温度下的无细胞表达混合物中的至少2个非天然氨基酸(nnaa)，其中所产生的所述多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少30％(w/w)。例如，对于总量100g的多肽，所述不可溶级分将为70g或更少，并且所述可溶级分将为30g或更多。在另一个实施例中，所述温度高于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度低于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度介于约14摄氏度与约18摄氏度之间。在另一个实施例中，所述多肽由包括抑制密码子的核酸编码。在另一个实施例中，所述无细胞表达混合物包括对所述nnaa具有特异性的正交trna/氨酰基-trna合成酶对。在另一个实施例中，所述nnaa的浓度为至少20μm(即，所述正交trna的浓度)。在另一个实施例中，所述nnaa的浓度低于约2mm，并且所述氨酰基-trna合成酶的浓度低于约5μm(即，所述正交合成酶的浓度)。在另一个实施例中，所述方法包括将所述多肽与活性部分缀合。在另一个实施例中，所述活性部分选自由以下组成的组：半抗原、细菌抗原、病毒抗原、肽毒素、大环内酯、聚醚和其任何组合。在另一个实施例中，所述表达混合物包括大肠杆菌、小麦胚芽或兔网织红细胞的细胞提取物。e.coli,wheat germ,or rabbitreticulocyte.在另一个实施例中，所述表达混合物包括至少30％的细胞提取物。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnaa。在另一个实施例中，所述nnaa选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸和其任何组合。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少60％(w/w)。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少80％(w/w)。例如，对于总量100g的多肽，所述不可溶级分将为20g或更少，并且所述可溶级分将为80g或更多。
39、在一个实施例中，本公开提供了一种制备蛋白质-缀合物疫苗的改进的方法，其中抗原与提供t细胞依赖性免疫应答的载体蛋白缀合，所述改进包括将多肽用作所述载体蛋白，所述多肽包括至少一个非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述抗原为细菌多糖。在另一个实施例中，所述多肽包括至少两个非天然氨基酸，所述至少两个非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述多肽包括至少一个t细胞活化表位，所述至少一个t细胞活化表位不包括非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述t细胞活化表位来自蛋白质，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白d(pd、hid)、血清组b脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(ompc)和crm197。在另一个实施例中，所述抗原为细菌多糖，并且所述细菌选自由以下组成的组：肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，hib)、酿脓链球菌和无乳链球菌。在另一个实施例中，所述非天然氨基酸中的至少一个非天然氨基酸选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸。
40、在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生载体蛋白的方法，所述载体蛋白将多个非天然氨基酸并入其结构中，所述方法包括：(a)提供编码载体蛋白的核酸，其中所述核酸包括多个抑制密码子；(b)通过将所述核酸与无细胞的细菌提取物组合来产生反应混合物，所述无细胞的细菌提取物包括所述非天然氨基酸、与所述抑制密码子互补的trna和氨酰基-trna合成酶；以及(c)在足以选择性地在对应于所述载体蛋白中的每个抑制密码子的位点处并入所述非天然氨基酸的条件下培育(b)的所述反应混合物。在另一个实施例中，所述非天然氨基酸为4-叠氮甲基苯丙氨酸(pamf)。在另一个实施例中，步骤(c)包括在低于20摄氏度下培育所述反应混合物。在另一个实施例中，所述方法另外包括在(c)之后立即纯化所述载体蛋白。在另一个实施例中，在seq id no:2的密码子25、34、38、40、213、215、228、245、265、386、523或527处选择性地取代所述抑制密码子。在另一个实施例中，(b)中的所述反应混合物进一步包括蛋白质合成所必需的生物组分。在另一个实施例中，(b)中的所述trna能够通过pamf带电。在另一个实施例中，与20个天然氨基酸相比，(b)中的所述氨酰基-trna合成酶优选地用pamf氨酰化所述trna。
41、在另一个实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其中所述抗原为荚膜多糖，并且(a)每种不同的载体蛋白-抗原缀合物中的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌的不同血清型；(b)所述载体蛋白-抗原缀合物的所述载体蛋白包括多肽，所述多肽包括至少一个t细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(nnaa)；并且(c)所述荚膜多糖与所述nnaa缀合。在此实施例的优选版本中，根据seq id no:1，所述至少一个t细胞活化表位来自crm197；所述多肽与seq id no:1具有至少80％或95％的序列一致性；并且(i)所述多肽包括2-9个nnaa；(ii)所述多肽包括4-6个nnaa；和/或(iii)至少一个nnaa取代选自由以下组成的组的氨基酸：(a)crm197的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、、k245、k265、k386、k523、k527；(b)seq id no:1的f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532；或(c)seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523、k527、f13、f54、f124、f128、f141、f168、f251、f390、f531或f532。前述实施例的优选版本包含：包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中每种不同的载体蛋白-抗原缀合物包含单独地选自肺炎链球菌血清型的所述荚膜多糖的抗原，所述肺炎链球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f；至少24种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的24种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f；包括至少25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的至少一种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型，所述肺炎链球菌血清型选自由以下组成的组：6c、7c、13、15a、15c、16、16f、23a、23b、24f、31、34、35b、33f、35f、37和38；以及包括至少25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的至少一种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型，所述肺炎链球菌血清型选自由15a和35b组成的组或者可替换地选自由20a、20b和24b组成的组。
42、在一个实施例中，本公开提供了包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述抗原为肺炎链球菌的荚膜多糖，其中(a)每种不同的载体蛋白-抗原缀合物中的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌的不同血清型；(b)所述载体蛋白-抗原缀合物的所述载体蛋白是包括至少一个t细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(nnaa)的多肽，并且所述荚膜多糖与所述nnaa缀合；(c)存在不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包括肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f和23f中的每种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖；并且(d)存在至少一种另外的不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包括来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，所述肺炎链球菌血清型选自由以下血清型组成的组：2、6c、8、9n、10a、12f、15a、15b、15c、16f、17f、20、20a、20b、22f、23a、23b、24f、24b、31、33f、34、35b、35f和38。例如，所述组合物可以包含：(i)至少20种或21种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包含肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、10a、11a、12f、14、15b、18c、19a、19f、22f、23f和33f中的每种肺炎链球菌血清型的缀合物；或(ii)至少24种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其中存在包括肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f中的每种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖的不同的载体蛋白-抗原缀合物。
43、在一个实施例中，本公开提供了一种多肽-抗原缀合物，其中所述多肽包含3个或更多个nnaa残基，并且所述缀合物具有至少500kda的分子量。所述多肽可以是含有3个或更多个nnaa残基(例如，3-9个或3-8个或3-7个或3-6个nnaa残基)的crm197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与seq id no:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述抗原可以是如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖。所述缀合物的分子量可以为至少600kda、至少800kda、至少900kda或至少1mda，例如介于1-5mda之间。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
44、在一个实施例中，本公开提供了一种多肽-抗原缀合物，其中所述多肽包含4个或更多个nnaa残基。所述多肽可以是含有4个或更多个nnaa残基(例如，4-9个或4-8个或4-7个或4-6个nnaa残基)的crm197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与seq id no:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述抗原可以是如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖。所述缀合物的分子量可以为至少500kda(例如，至少600kda、至少800kda、至少900kda或至少1mda，例如，在1-5mda之间)。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
45、在一个实施例中，本公开提供了一种适于制备免疫原性多糖-蛋白质缀合物的蛋白质，其中所述蛋白质(i)包含至少一个nnaa并且(ii)在20℃下，在ph值为7.4的tris缓冲液中具有至少50mg/l的溶解度。所述多肽包括至少一个t细胞活化表位(如上文所讨论的)；例如，所述多肽可以是含有2个或更多个nnaa残基(例如，3-9个或4-9个或3-8个或4-8个或3-7个或4-7个或3-6个或4-6个nnaa残基)的crm197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与seq id no:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述蛋白质可以与如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖缀合以制备缀合物。溶解度可以为至少100mg/l、至少200mg/l或甚至至少250mg/l。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
技术特征：
1.一种缀合物，其包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(‘nnaa’)残基的载体蛋白，其中(i)所述载体蛋白包括来自蛋白质的至少一个t细胞活化表位，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)毒素、破伤风梭菌(clostridium tetani)破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)蛋白d和crm197，并且(ii)所述抗原与所述nnaa残基缀合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体蛋白包括4到9个nnaa残基。
3.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中至少一个nnaa取代所述天然载体蛋白中的赖氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白与seq id no:1具有至少80％的序列一致性。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中至少一个nnaa取代seq id no:1的k25、k34、k38、k40、k213、k215、k228、k245、k265、k386、k523或k527。
6.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白包括氨基酸序列seqid no:9。
7.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个nnaa为2,3-双取代的丙酸，所述2,3-双取代的丙酸带有：在2位处的氨基取代基；在3位处的含叠氮基的取代基、1,2,4,5-四嗪基取代基或含乙炔基的取代基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述nnaa选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(paf)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pamf)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原经由三唑连接部分与所述nnaa缀合。
10.一种缀合物，其包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个t细胞活化表位和至少一个非天然氨基酸(nnaa)的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnaa缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnaa残基对应于具有式xii结构的氨基酸：
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中：w6为叠氮基；ar为亚苯基，或ar含有氮杂原子以及任选地至少一个选自n、o和s的另外的杂原子；q1为1；和/或w5为低级亚烷基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原根据式xi或xia与所述载体蛋白连接：
13.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原为细菌荚膜多糖；例如来自细菌的荚膜多糖，所述细菌选自由以下组成的组：肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)和牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)。
14.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、13、14、15b、16、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、31和33f。
15.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中多糖与载体蛋白的比率(w/w)大于1。
16.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述多肽包含3个或更多个nnaa残基，并且所述缀合物具有至少500kda的分子量。
17.根据权利要求15所述的缀合物，其中所述多肽(a)为crm197或包括与seq id no:1具有至少80％序列一致性的氨基酸序列，并且(b)包括3-9个nnaa残基。
18.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物通过蛋白质-抗原-蛋白质连接交联。
19.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物具有至少900kda的分子量。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其具有介于900kda与5mda之间的分子量。
21.一种用于产生缀合物的方法，其包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一化学柄包括炔烃基团和/或所述第二化学柄包括叠氮基。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述抗原与第二试剂反应，所述第二试剂包括选自由炔丙基、difo、dbco、dbco-nh2和dbco(peg)n-nh2组成的组的官能团。
24.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中(i)所述抗原包括式v、式vi或式via结构：
25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法，其用于产生根据权利要求1到20中任一项所述的缀合物。
技术总结
公开了用于产生含有非天然氨基酸的免疫原性组合物的方法。所述非天然氨基酸可以是附着如细菌荚膜多糖等抗原以制备免疫原性缀合物的位点。并入所述非天然氨基酸中的生物正交附着化学实现针对免疫系统的更高效和更有力的抗原呈递、简化的纯化和这些半合成免疫原的更明确限定的结构。
技术研发人员：J·费尔曼,J·海因里希斯,W·陈
受保护的技术使用者：VAXCYTE公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23