CD20单域抗体及其人源化抗体F11的制作方法

本技术涉及生物医药领域，具体涉及cd20单域抗体及其人源化抗体f11。

背景技术：

1、b细胞在人体的体液免疫反应和抗原递呈上发挥重要的作用。b细胞病变所带来的后果十分严重，其造成的疾病主要为两大类，第一类为恶性b细胞血液癌症，第二类则为非正常的b细胞识别自身抗原造成的自免疫类疾病。cd20在b细胞的免疫应答过程中发挥着重要的作用，从pro-b晚期开始出现，且其表达水平随b细胞的成熟逐渐上升。cd19是表达于b淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(ig)超家族成员，cd19在早期b细胞的发育中扮演重要的角色，所有的b细胞性急性白血病都表达cd19。

2、在car-t(嵌合抗原受体t细胞)治疗中，这两种抗原成为治疗某些类型b细胞恶性肿瘤(如非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病)的关键靶点。

3、car是一种人工重组蛋白，主要由抗原识别区、细胞外铰链区、跨膜区、细胞内信号传递域组成。胞外域是从单克隆抗体中纯化的抗原靶向部分，与肿瘤抗原结合后触发细胞活化，介导细胞因子释放、细胞溶解脱颗粒和t细胞增殖，它决定了反应的质量、强度以及t细胞对肿瘤抗原反应的持续性，跨膜区主要用于维持car结构，t细胞受体构成激活t细胞所需的信号通路的细胞内信号传递域。car-t扩增后可产生强大的免疫应答效应攻击破坏肿瘤。

技术实现思路

1、针对目前car技术治疗肿瘤中单一靶向的长期效果不十分理想，以及肿瘤微环境影响car技术治疗效果的情况，本技术提供一种新的cd20抗体，并基于该抗体串联cd19抗体构建双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，尤其提供一种car-t细胞用于细胞治疗。

2、本技术采用的技术方案是：

3、第一方面，本技术提供了一种特异性结合cd20的cd20抗体，所述抗体包含3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，所述抗体的互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，互补决定区cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，互补决定区cdr3的氨基酸序列如seq idno.3所示。

4、优选地，所述cd20抗体包括单域抗体、单克隆抗体、单链抗体、fab、fab’、fv片段、f(ab’)2、scfv、di-scfv等抗原结合片段。

5、优选地，所述cd20抗体是单域抗体。

6、本发明所述单域抗体也可以称为“纳米抗体(nanobody，nb)”、“vhh抗体(variabledomain ofheavychain of heavy-chain antibody，vhh antibody)”、“单域重链抗体(singledomain antibody，sdab)”，是指仅由重链抗体可变区(variable region)组成的基因工程抗体。

7、进一步，所述cd20抗体还包括cd20抗体的功能保守变体或功能性变异体。

8、具体地，所述抗体的功能保守变体包括极性、氢键电位、酸度、碱度、疏水性、芳族基团等形式替换氨基酸。所述“功能保守变体”是指其中替换根据本技术的抗体中的给定氨基酸而不损害抗体的整体构象和功能的变体，包括使用具有相似的性质(例如，极性、氢键电位、酸度、碱度、疏水性、芳族基团的存在等)的另一种替换一种氨基酸。具有相似性质的氨基酸是本领域技术人员熟知的。

9、具体地，所述功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似但包括本技术的亲本抗体没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化，这样的功能性变异体同样包含在本技术的保护范围内。

10、优选地，所述抗体是人源化的。人源化的抗体的免疫原性理论上应比嵌合抗体少，更适合大量及重复使用。

11、优选地，所述cd20抗体具有seq id no.4-9任意一种所示的氨基酸序列。

12、优选地，所述cd20抗体还包括与seq id no.4-9所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列所对应的单域抗体，也即在对应的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸或核苷酸替换为其他任意氨基酸或核苷酸之后得到的氨基酸序列或核苷酸序列，只要与本技术上述的氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本技术的保护范围内。

13、第二方面，本技术提供了一种人源化的cd19抗体，所述cd19抗体包含vh和vl，所述vl的氨基酸序列如seq id no.24所示，所述vh的氨基酸序列如seq id no.28所示；或者，所述vl的氨基酸序列如seq id no.25所示，所述vh的氨基酸序列如seq id no.29所示。

14、优选地，所述vh和vl通过接头(linker)连接。

15、第三方面，本技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白中含有本技术第一方面所述cd20抗体和本技术第二方面所述cd19抗体。

16、更具体地，所述融合蛋白由n端至c端依次为：前述cd20、第一linker、前述cd19抗体的轻链可变区、第二linker和前述cd19抗体的重链可变区。

17、所述第一linker和第二linker可以相同或不同。

18、本技术所述linker(又称融合蛋白接头、接头)包括(ggggs)n、(gggs)n、(ssssg)n、(gsgsa)n和(ggsgg)n等。优选地，所述linker还可以包括其他氨基酸。

19、第四方面，本技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含以下任意一种：第一方面所述cd20抗体、本技术第二方面所述cd19抗体或本技术第三方面所述融合蛋白。

20、优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区。更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：cd8α、cd28、cd34、4-1bb、ox40、cd3ε、igg1、igg4、pd-1、il-2受体、il-7受体、il-11受体。最优选地，所述铰链区为cd8α铰链区。

21、优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：cd8α、cd28、4-1bb、cd34、cd3ε、pd-1、igg1、igg4、ox40、il-2受体、il-7受体、il-11受体。最优选地，所述跨膜结构域为cd8α跨膜结构域。

22、优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域。优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1bb(cd137)、cd19、cd4、cd27、cd28、icos(cd278)、cd8α、cd8β、baffr、hvem、light、kirds2、slamf7、nkp30、nkp46、cd40、cds、icam-1、b7-h3、ox40、dr3、gitr、cd30、tim1、cd2、cd7、cd226。最优选地，所述共刺激信号结构域为41bb共刺激信号结构域。

23、优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域。优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：cd3ζ、cd3γ、zap70、cd3δ、cd3ε、fcrγ、fcrβ、tcrζ、cd4、cd5、cd8、cd21、cd22、cd79a、cd79b、cd278、fcεri、dap10、dap12、cd66d。最优选地，所述胞内信号传导结构域为cd3ζ(cd3z)胞内信号传导结构域。

24、优选地，所述嵌合抗原受体由n端至c端依次为：第一方面所述cd20抗体/本技术第二方面所述cd19抗体/本技术第三方面所述融合蛋白-cd8铰链区-cd8跨膜结构域-41bb共刺激结构域-cd3ζ胞内信号传导结构域。

25、术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。car是嵌合抗原受体t细胞(car-t)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。本技术的car可以包含为了分子的适当间隔和构象而添加的在各个域之间的接头(linker)连接。car是工程化的受体，可将任意特异性受体植入到免疫效应细胞上，本技术中尤其是指t细胞，也即制备成为car-t细胞。

26、另一方面，本技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本技术前述：cd20抗体、cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体中的一种或多种。

27、另一方面，本技术提供了一种重组载体，其中包含前述核酸分子。

28、优选地，所述载体包括dna载体、rna载体、质粒、病毒来源的载体。

29、更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。

30、在某些实施方案中，本技术对载体没有特别的限制，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒载体、病毒来源的载体、噬菌体载体和其他常规用于例如遗传工程的载体。可基于本领域技术人员众所周知的方法构建各种质粒和载体。

31、在另一方面，本技术提供了一种经工程改造的细胞，所述细胞中包含或者表达前述cd20抗体、cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体；

32、或者，所述细胞是由前述重组载体所制备得到的，例如，可将本技术所述的载体引入所述细胞中，可通过本领域已知的方法将本技术所述的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。

33、优选地，所述细胞为人的细胞。

34、更优选地，所述细胞为免疫细胞。

35、优选地，所述免疫细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、inkt细胞、ctl细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、gdt细胞、ips来源的任何免疫细胞或其任意组合。

36、优选地，所述免疫细胞为t细胞。

37、最优选地，所述细胞为car-t细胞。

38、另一方面，本技术提供了一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物包含本技术所述cd20抗体或cd19抗体，所述cd20抗体或cd19抗体缀合至一种或多种药物。

39、另一方面，本技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有：前述cd20抗体、cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物中的一种或多种。

40、优选地，所述药物组合物中还含有药学或生理学上可接受的载体和/或辅料。

41、在某些实施方案中，所述药学或生理学上可接受的载体和/或辅料可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本技术所述前述cd20抗体、cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物中的一种或多种还可与其他治疗剂一起使用。

42、优选地，所述药物组合物中含有表达前述嵌合抗原受体的t细胞。

43、在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。

44、本技术提供的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由临床医师根据受试患者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它本领域技术人员公知的任何合适的给药方式。

45、另一方面，本技术提供了一种含有标记的抗体，所述抗体是前述cd19抗体和/或cd20抗体。

46、优选地，所述标记包括放射性核素、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。

47、在某些实施方案中，可以将含有标记的抗体组装成试剂盒进行cd19和/或cd20的检测。所述试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等，在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于溶解待测样品的裂解介质、检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

48、另一方面，本技术提供一种预防和/或治疗cd20相关癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的前述cd20抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物、药物组合物。

49、另一方面，本技术提供一种预防和/或治疗cd20相关癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的前述cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物、药物组合物。

50、具体地，所述方法是向受试者施用治疗有效量的car-t细胞，所述car中具有本技术所提供的cd20抗体和/或cd19抗体。

51、在本技术中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，具体可以包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的或粘膜的。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。

52、在本技术中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。

53、另一方面，本技术提供一种用于检测cd20蛋白或诊断cd20相关癌症的方法，所述方法包括使样本与本技术前述cd20抗体、融合蛋白接触并检测复合物，其中检测所述复合物指示所述样本中的cd20蛋白表达。

54、另一方面，本技术提供一种用于检测cd19蛋白或诊断cd19相关癌症的方法，所述方法包括使样本与本技术前述cd19抗体、融合蛋白接触并检测复合物，其中检测所述复合物指示所述样本中的cd19蛋白表达。

55、优选地，所述检测是针对离体样本在体外进行的检测。

56、优选地，所述检测是非诊断目的的。

57、优选地，所述检测可以是定性的、定量的、或半定量的。

58、另一方面，本技术提供了任意以下一种或多种产品在检测cd20、制备cd20相关癌症的诊断产品及药物中的应用：前述cd20抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物、药物组合物。

59、另一方面，本技术提供了任意以下一种或多种产品在检测cd19、制备cd19相关癌症的诊断产品及药物中的应用：前述cd19抗体、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞、抗体药物偶联物、药物组合物。

60、优选地，本技术所述cd19相关癌症包括淋巴瘤和白血病。

61、优选地，所述cd19相关癌症是白血病。

62、优选地，所述cd19相关癌症是慢性髓系白血病。

63、优选地，本技术所述cd20相关癌症包括淋巴瘤和白血病，具体包括非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、多发性硬化症、类风湿性关节炎、边缘区淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、狼疮性肾炎、套细胞淋巴瘤、系统性红斑狼疮、天疸疮、免疫性血小板减少症、肢性肾病、b细胞血癌、急性淋巴细胞白血病、显微镜下多血管炎、肾移植排斥、肾病综合征。

64、优选地，本技术具体实施例中以慢性髓系白血病的细胞系为靶细胞进行实验验证。

65、本技术所述术语“t细胞”或“t淋巴细胞”可以是任何t细胞，如培养t细胞、原代t细胞或获自哺乳动物的t细胞(优选灵长类动物，物种，包括猴、狗或人)。t细胞可以是任何类型的t细胞，包括nkt细胞，并且可以具有任何发育阶段。如果获自哺乳动物，那么t细胞可以获自诸多来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。

技术特征：

1.一种特异性结合cd20的cd20抗体，所述抗体包含3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，所述抗体的互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，互补决定区cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，互补决定区cdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示；

2.一种人源化的cd19抗体，所述cd19抗体包含vh和vl，所述vl的氨基酸序列如seq idno.24所示，所述vh的氨基酸序列如seq id no.28所示；或者，所述vl的氨基酸序列如seqid no.25所示，所述vh的氨基酸序列如seq id no.29所示。

3.一种融合蛋白，所述融合蛋白中含有权利要求1所述cd20抗体和权利要求2所述cd19抗体。

4.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含以下任意一种：权利要求1所述cd20抗体和权利要求2所述cd19抗体或权利要求3所述所述融合蛋白；

5.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，所述核酸分子编码权利要求1所述cd20抗体、权利要求2所述cd19抗体、权利要求3所述所述融合蛋白、权利要求4所述嵌合抗原受体中的一种或多种；

6.一种经工程改造的细胞，所述细胞中包含或者表达权利要求1所述cd20抗体、权利要求2所述cd19抗体、权利要求3所述所述融合蛋白权利要求4所述嵌合抗原受体、权利要求5所述核酸分子或重组载体中的一种或多种；

7.一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物包含抗体，所述抗体缀合至一种或多种药物，所述抗体是权利要求1所述cd20抗体和/或权利要求2所述cd19抗体。

8.一种药物组合物，所述药物组合物中含有：权利要求1所述cd20抗体、权利要求2所述cd19抗体、权利要求3所述所述融合蛋白权利要求4所述嵌合抗原受体、权利要求5所述核酸分子或重组载体、权利要求6所述细胞、权利要求7所述抗体药物偶联物中的一种或多种；

9.一种含有标记的抗体，所述抗体是权利要求1所述cd20抗体和/或权利要求2所述cd19抗体；

10.一种应用，所述应用选自：

技术总结
本申请涉及生物医药领域，具体涉及CD20单域抗体及其人源化抗体F11。具体地，本申请提供了一种特异性结合CD20的CD20抗体，所述抗体包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述互补决定区CDR1、CDR2、CDR3依次如SEQ ID NO.1‑3所示。进一步基于该抗体串联CD19抗体构建双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，尤其提供一种CAR‑T细胞用于细胞治疗。

技术研发人员：刘春蕙,李宜声,孟上森,赖麒安
受保护的技术使用者：深圳豪石生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23