包含免疫原性屈公病毒CHIKV-DELTA5NSP3的医药组成物的制备方法与流程

本发明是关于一种产生免疫原性减毒活屈公病毒的方法，以及包括所述病毒的医药组成物。

背景技术：

1、屈公病毒(chikungunya virus，chikv)为披衣病毒科α病毒属的正义单股rna病毒。屈公病毒病主要为一种爆发性疾病，且与高发病率有关。病毒经由蚊媒传播给人类，且引起发热、皮疹、疲劳及严重的多发性关节痛。chikv感染一般会自发消退且通常不会致命，除非是在涉及cns感染的罕见病例中，在所述罕见病例中，死亡率在10％至30％之间。一岁以下的婴儿及65岁以上的成年人尤其具有chikv cns疾病的风险，其感染率分别比一般人群高25倍及6倍。儿童在chikv脑炎后的持续性残疾率估计在30％与45％之间(gerardin p等人chikungunya virus-associated encephalitis a cohort study on la réunionisland,2005-2009(2016)neurology 86:1-9)。此外，所有屈公患者中约30％在康复后数月至数年出现关节痛。在一些情况下，可能发生神经、肾、心脏、呼吸或肝脏的并发症。

2、目前没有疫苗或药物可用于预防或治疗屈公病毒病。过去的爆发主要发生在非洲，但东中南非(east-central southafrican，ecsa)基因型最近扩大了其地理范围，导致印度、亚洲、甚至温带欧洲都有爆发(weaver,s.,arrival of chikungunya virus in thenew world:prospects for spread and impact on public health(2014)plosneglected tropical diseases 8(6):e2921)。尽管chikv自1995年以来一直重复引入美洲，但直到2013年才在加勒比地区(caribbean)报导了原地传播。到2015年，所述流行病扩散至大陆，且在美洲27个国家造成了超过100万例疑似病例(pan-american healthorganization(2015)number ofcumulative cases ofchikungunya fever in theamericas)。进一步的流行病可能部分得益于chikv蚊媒向非流行地区的扩散，以及chikv适应当地蚊子物种的能力(vega-rua a等人,chikungunya virus transmission potentialby local aedes mosquitoes in the americas and europe(2015)plos neglectedtropical diseases doi:10.1371/journal.pntd.0003780)。屈公病毒的高传染率、其地理扩散及其长期并发症的可能性强调了对开发诸如疫苗的预防措施的需求。

3、针对屈公病毒的疫苗可包括减毒活chikv粒子；亦即，已发生改变以降低毒力，但仍保持免疫原性的活的chikv粒子。减毒chikv的一个实例在非结构蛋白3中含有缺失突变(chikv-δ5nsp3；参见图2)。已证实，chikv-δ5nsp3在小鼠(d等人,novelattenuated chikungunya vaccine candidates elicit protective immunity inc57bl/6mice(2014)j.virol.88:2858-2866)及非人类灵长类动物(roques p等人,attenuated and vectored vaccines protect non-human primates againstchikungunya virus(2017)j.clin.invest.insight 2(6):e83527)中可赋予保护性免疫。在小鼠及非人类灵长类动物中的此等初步活体内研究是用在bhk-21细胞上产生的chikv-δ5nsp3病毒进行的，所述细胞为一种通常不利于人类疫苗的产生的细胞类型。因此，如本文所揭示，有必要使chikv-δ5nsp3病毒的产生适应更适合的细胞培养平台。这种适应不是一个微不足道的过程；例如，此项技术中已知，病毒对特定宿主细胞的适应可导致会改变病毒粒子的表面电荷的突变。此类后天性突变可用以减弱病毒；事实上，已在使用连续继代来开发此类减毒病毒粒子，其用于诸多针对病毒的疫苗中。关于chikv，已证实，毒性野生型屈公病毒的重复活体外继代可导致某些点突变，导致病毒部分或完全减毒(gardner cl等人,deliberate attenuation of chikungunya virus by adaptation to heparan sulfate-dependent infectivity:a model for rational arboviral vaccine design(2014)plosneglected tropical diseases 8(2):e2719)。

4、现在令人惊讶地发现，导致免疫原性丧失的某些点突变可能在减毒chikv-δ5nsp3的细胞受质适应过程中较早发生，使得控制或减少所述点突变成为产生成功候选疫苗的必要考虑因素。因此，本发明提供一种方法，其具有用于chikv-δ5nsp3候选疫苗的繁殖的明确定义的参数，允许产生高免疫原性病毒粒子，同时在适合工业应用的细胞培养物中达成高生产效价。

技术实现思路

1、本发明涉及一种医药组成物，其包括足量的免疫原性屈公病毒以在受试者中引发中和免疫反应；亦即，一种提供针对屈公病毒感染及/或由屈公病毒引起的疾病的保护的免疫反应。详言之，本发明提供一种包括减毒活chikv-δ5nsp3粒子的医药组成物，其中含免疫原性降低突变、尤其是e2蛋白中的免疫原性降低突变的所述病毒粒子的百分比降至最低。本发明进一步提供一种制造包括减毒活chikv-δ5nsp3的医药组成物的方法，其中所述方法使病毒基因组中的免疫原性降低突变、尤其是在病毒e2蛋白的e168及/或其他e2残基及/或其他结构或非结构chikv蛋白中的残基处的突变的存在降至最低。本发明进一步提供可藉由本发明方法获得的包括免疫原性减毒活屈公病毒的医药组成物。

2、目前正在努力开发针对屈公病毒的疫苗。最先进的候选疫苗之一在麻疹病毒平台中提供嵌合构筑体(参见http://www.themisbio.com/#/news)。该疫苗目前处于2期试验阶段，分两个剂量递送(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct02861586？term＝themis&recrs＝a&rank＝2)。单次注射疫苗(one-shot vaccine)将在该领域中体现出独特优势。

3、因此，在一个实施例中，本发明的一个目标为提供一种稳定的、已有明确定论的、安全且有效的医药组成物，诸如针对屈公病毒的疫苗，较佳为仅用一次疫苗接种即可提供保护的改良疫苗；亦即，在工业规模上使用常见细胞受质的所谓的「单次注射」疫苗，提供产生此类稳定的、已有明确定论的、安全且有效的疫苗的方法，以及有关所述稳定的、已有明确定论的、安全且有效的疫苗的方法及用途。

技术特征：

1.一种医药组成物，包括chikv-δ5nsp3粒子，其中所述医药组成物包含

2.如权利要求1所述的医药组成物，其中(ii)的chikv-δ5nsp3粒子是表达于seq idno:2的氨基酸序列中有九个、八个、七个、六个、五个或四个、或不多于三个、或一个或两个突变的e2结构蛋白。

3.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述突变是选自于会影响chikv-δ5nsp3粒子的免疫原性的突变以及不会影响chikv-δ5nsp3粒子的免疫原性的突变。

4.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述医药组成物包含至少104个或至少105个表达由seq id no:2的氨基酸序列所定义的e2结构蛋白的chikv-δ5nsp3粒子。

5.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述医药组成物中的chikv-δ5nsp3粒子的1-50％或5-30％是表达于seq id no:2的氨基酸序列中有不多于十个突变的e2结构蛋白。

6.如权利要求1所述的医药组成物，其中(i)的chikv-δ5nsp3粒子是由dna序列seq idno:1编码。

7.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述医药组成物在经所述医药组成物免疫的小鼠中诱导针对chikv-δ5nsp3的中和抗体，产生包括所述中和抗体的血清，且其中，在活体外中和分析中，在1:80血清稀释下，所述血清将vero细胞的屈公病毒(chikv)感染中和至少80％、至少90％、至少95％。

8.如权利要求1所述的医药组成物，其藉由在vero细胞中产生chikv-δ5nsp3粒子而获得或可如此获得，其中所述产生包括在病毒援救后，使具有由seq id no:1所定义的多核苷酸序列的chikv-δ5nsp3粒子在vero细胞上继代少于五次或最多三次。

9.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述医药组成物是单次注射医药组成物。

10.如权利要求1所述的医药组成物，其中所述医药组成物为疫苗，为冻干形式及/或经制备以供皮下投与。

技术总结
本发明是关于一种产生免疫原性减毒活屈公病毒(Chikungunya virus)的方法，以及包括所述病毒的医药组成物。

技术研发人员：安卓·福礼兹尔,安德烈雅斯·曼基,厄本·伦德柏格,玛力欧·尼本福尔,尤尔根·汉迪-沃瑞斯,罗伯特·史莱格,阿诺德·里昂
受保护的技术使用者：瓦尔尼瓦公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23