一种定量检测全血生物标志物自泵式微流控芯片

本发明涉及暗场显微镜检测肿瘤标志物，具体涉及一种定量检测全血生物标志物自泵式微流控芯片。

背景技术：

1、在临床样本检测中，高灵敏和精确地定量检测生物标志物在早期的筛查和监测中具有至关重要的意义，针对高灵敏、简易便携式快速检测，已成为了研究热点。现有的常规检测方法，如酶联免疫吸附试验(elisa)和(pcr)等，在全血样本检测中存在分离血浆血细胞复杂、人工操作繁琐、灵敏度低等缺点，elisa和pcr这两种方法都需要复杂的前处理程序和精密仪器，只有专业人员才能操作，在实际应用中受到很大的限制。

2、微流控芯片在微尺度和功能集成方面弥补了传统检测方法造成的上述缺点，同时，微流控芯片在检测过程还减少了试剂和样品消耗，提升了检测灵敏度，为复杂真实样品中的癌症标志物检测提供了一个更高效的平台。然而已报道的用于肿瘤标志物的微流控芯片无法将血液分离和检测融为一体，通常需要多个步骤，如额外的微流控注射泵、连接器大型测试系统，才能实现生物标志物检测，使得整个微流控系统大大增加了成本，并且限制了应用场景。虽然已经报道了一些无泵小型化的微流控系统，然而，这些无泵微流控芯片流量控制和微阀制造方面存在不足，这也是一些软微流体系统设计不可避免的问题，并且此类微流控传感芯片不能满足对全血样本中标志物的便携式需求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种定量检测全血生物标志物自泵式微流控芯片，以解决现有全血样本分离、检测操作繁琐以及体系过大和非一体化的问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，包括玻璃衬底和盖板，盖板设置于玻璃衬底上；盖板上设置有依次连通的进样口、功能微管道和出样口；进样口和出样口均为通孔，进样口包括第一进样口、第二进样口和第三进样口；功能微管道为凹槽，功能微管道设置于靠近玻璃衬底的盖板底部，功能微管道包括依次连通的混合微管道、反应腔、分离微管道、检测区、第一特斯拉微阀、按压腔和第二特斯拉微阀，混合微管道和进样口连通，第二特斯拉微阀和出样口连通；分离微管道上连通设置有磁珠堆积区，磁珠堆积区旁，设置有磁铁放置区；第一进样口上设置有储液池，储液池底部设置有滤膜；检测区的玻璃衬底表面设置有正电荷。

3、本发明的有益效果为：本发明的芯片主要包括玻璃衬底、过滤装置和功能微通道。玻璃衬底用于固定功能微通道，形成封闭微腔；过滤装置用于将全血样本中的血细胞与血清分离，本发明的过滤装置即为储液池和滤膜，能够容纳含有生物标志物的全血样本，且过滤纸的底部正对下方盖板的第一进样口，含有生物标志物的全血样本通过滤纸流入第一进样口；功能微通道用于肿瘤标志物的混合、反应、检测等功能，其中，混合微管道用于将第一进样口的血浆和第二进样口的检测探针混合，然后流入反应腔，使检测探针的适配体特异性识别抗原，从而将检测探针的连接在磁珠表面的金纳米颗粒释放在血浆中，检测探针进而分离为两部分，磁铁将分离后的磁珠堆积在磁珠堆积区，利用荧光显微镜对磁珠的荧光强度进行测定，检测区的玻璃表面带有阳离子，使得经过的连接有抗原的金纳米颗粒吸附在此处，通过暗场显微镜中呈现的绿色光斑数量实现对生物标志物定量的检测；第一特斯拉阀和第二特斯拉阀是单向控制阀，可以实现液体的正向快速通过，防止液体逆向回流；按压腔通过手指的按压，使得微流控芯片内部形成负压，利用该负压实现液体的运输流动。

4、本发明的微流控芯片结构简单、方便操作、对样本无污染，结合暗场显微镜成像检测技术，可准确的对人全血样本中的前列腺标志物或肿瘤标志物进行过程性判断和定量检测。

5、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

6、进一步，检测区的玻璃衬底表面正电荷通过以下方法制得：将检测区的玻璃衬底表面浸泡在食人鱼溶液中，然后冲洗、氮气吹干，再在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷的酒精溶液中浸泡，继续冲洗、氮气吹干，加热，得到修饰有正电荷的玻璃衬底表面。

7、进一步，将检测区的玻璃衬底表面浸泡在60℃的食人鱼溶液中30min。

8、进一步，食人鱼溶液为体积比为7：3的浓硫酸和过氧化氢的混合物。

9、进一步，用去离子水冲洗。

10、进一步，在含有3-氨丙基三乙氧基硅烷的酒精溶液中浸泡3h。

11、进一步，酒精溶液中3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为10wt％。

12、进一步，混合微管道包括依次连通的第一微管道、第二微管道和第三微管道，所述第一微管道连通进样口，第二微管道为s型，第三微管道连接反应腔。

13、采用上述进一步技术方案的有益效果为：经过进样口的液体由于层流的作用，致使液体分层，通过s型管道减缓液体流动，增加液体中颗粒之间的相互交换，从而达到血浆和检测探针两种液体的充分混合，融为一体。

14、进一步，盖板的材质为聚二甲基硅氧烷。

15、采用上述进一步技术方案的有益效果为：盖板的材质采取聚二甲基硅氧烷，便于观察：透明度高、没有自发荧光不会干扰观察，生物兼容性好，不会影响实验；低成本；易加工：pdms对固化温度要求不高、可根据比例和温度调整软硬，软能可穿戴、硬能微流控，切割打孔可全手动操作，改动起来简单。

16、进一步，所述储液池的材质为聚二甲基硅氧烷。

17、进一步，所述储液池具有进口和出口，所述进口的孔径小于所述出口的孔径，所述进口至所述出口形成流动通道，且所述出口设置有滤膜。

18、采用上述进一步技术方案的有益效果为：盖板和储液池之间因pdms相互作用而键合，避免漏液，储液池上小下大是为了能够把滤膜嵌在盖板中，类似于沉孔，使得滤膜和盖板形成封闭，不会导致漏液。

19、进一步，滤膜为快速过滤纸。

20、进一步，反应腔、检测区、按压腔的深度均大于混合微管道、分离微管道、第一特斯拉微阀或第二特斯拉微阀的深度。

21、进一步，按压腔的深度＞检测区的深度＞反应腔的深度。

22、进一步，盖板的尺寸为75×25×7mm。

23、进一步，混合微管道的宽度为500μm，深度为100μm。

24、进一步，反应腔的直径为6mm，深度为0.8mm。

25、进一步，分离微管道的宽度为500μm，深度为100μm。

26、进一步，检测区的直径为4mm，深度1.6mm。

27、进一步，第一特斯拉微阀和第一特斯拉微阀的弧长均为1.41mm；半径均为1.35mm，深度为100μm。

28、进一步，按压腔直径为13mm，深度为4mm。

29、进一步，储液池出口的内孔径为6mm，进口的内孔径为4mm，储液池外径为9mm。

30、本发明还提供上述定量检测全血生物标志物自泵式微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

31、(1)光刻法制备盖板模具：通过autocad绘制出芯片，制备塑料掩膜板，在硅片表面涂覆su-8光刻胶，然后经过再经过前烘、曝光、加热固化和显影完成光刻过程，形成光刻胶图案，再在硅片四周设置边框，即得到盖板模具；

32、(2)盖板的制备：根据功能微管道的深度，在步骤(1)得到的盖板模具上粘贴不同高度的亚克力板，然后加入pdms预聚体和固化剂的混合溶液，去除气泡后，加热固化，然后去除盖板模具，将盖板的进样口和出样口打为通孔，制得盖板；

33、(3)储液池制备：采用激光雕刻制作储液池的内模具和外模具，然后将内模具和外模具夹持形成空腔，加入pdms预聚体和固化剂的混合溶液，去除气泡后，加热固化，然后去除内模具和外模具，制得储液池；

34、(4)将步骤(2)制得的盖板和玻璃衬底通过氧等离子键合连接，然后将步骤(3)制得的储液池和盖板的第一进样口也通过氧等离子键合连接，制得定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片。

35、进一步，步骤(4)中氧等离子键合包括以下步骤：将需要连接的表面进行氧等离子表面处理，然后对齐贴合，加热，完成氧等离子键合过程。

36、进一步，表面等离子清洗机中使用氧等离子体进行表面处理40s。

37、进一步，于75℃条件下加热10min。

38、本发明还提供一种定量检测全血生物标志物的方法，采用上述微流控芯片对全血生物标志物进行定量检测。

39、进一步，定量检测全血生物标志物的方法，包括以下步骤：

40、s1：将检测探针溶液注入第二进样口，将含有生物标志物的血液注入储液池；

41、s2：通过按压按压腔，将含有生物标志物的血液过滤，并和检测探针通过混合微管道混合，形成混合液，进入反应腔，反应20min；

42、s3：再次按压按压腔，使反应后的混合液分别流入磁珠堆积区和检测区，然后将去离子水自第三进样口灌入，通过按压按压腔，进行冲洗；

43、s4：磁珠堆积区用荧光显微镜进行观察，检测区用暗场显微镜进行观察，通过计数实现对目标物的检测。

44、进一步，s1中，生物标志物为肿瘤标志物。

45、进一步，步骤s1中，检测探针溶液、含有生物标志物的血液和s3中去离子水的体积比为1：1：2。

46、进一步，步骤s1中，检测探针溶液的浓度为500μg/ml。

47、进一步，检测探针为荧光适配体修饰的二氧化硅磁珠和核酸适配体修饰的金纳米颗粒的组装体，荧光适配体和核酸适配体之间可碱基互补配对，核酸适配体和生物标志物之间可碱基互补配对。

48、进一步，检测探针为荧光适配体修饰的二氧化硅磁珠和核酸适配体修饰的金纳米颗粒的组装体，所述荧光适配体和核酸适配体之间可碱基互补配对，所述核酸适配体和生物标志物之间可特异性识别捕获。

49、进一步，将核酸适配体采用进行羧基荧光素标记，得到荧光适配体。

50、进一步，检测探针通过以下方法制得：

51、s11：将活化的sh-dna溶液加入aunps溶液中，第一次孵育，分次加入nacl溶液，离心，加入至bsa溶液中，第二次孵育，洗涤，离心，得到核酸适配体修饰的aunps，pbs缓冲液中重悬，制得反应溶液一；

52、s12：在室温黑暗条件下，将二氧化硅磁珠溶液和荧光适配体溶液混合振荡，然后洗涤并进行磁分离，pbs缓冲液中重悬，得到荧光适配体修饰的二氧化硅磁珠溶液，加入步骤s11制得的反应溶液一，进行组装，洗涤，制得复合纳米材料，即检测探针。

53、进一步，步骤s11中，aunps溶液采用柠檬酸钠还原法制备。

54、进一步，步骤s11中，aunps溶液离心预处理，去除柠檬酸钠。

55、进一步，步骤s11中，sh-dna的序列为5′-ttgatggcgagctttaat-sh-3′。

56、进一步，步骤s11中，活化的方法为：在sh-dna溶液中加入tcep溶液避光反应30min。

57、进一步，sh-dna溶液和tcep溶液的体积比为10：1。

58、进一步，sh-dna溶液的浓度为10mmol/l。

59、进一步，tcep溶液的浓度为10mmol/l。

60、进一步，步骤s11中，sh-dna溶液和aunps溶液的体积比为1：500。

61、进一步，步骤s11中，sh-dna溶液的浓度为10μmol/l。

62、进一步，步骤s11中，aunps溶液的浓度为2.5nmol/l。

63、进一步，步骤s11中，在25℃条件下第一次孵育150min。

64、进一步，步骤s11中，nacl溶液的浓度为1mol/l。

65、进一步，步骤s11中，分次加入nacl溶液至体系中nacl的浓度为0.15mol/l。

66、进一步，步骤s11中，bsa溶液的浓度为1wt％。

67、进一步，步骤s11中，第二次孵育30min。

68、进一步，步骤s11中，aunps溶液和bsa溶液的体积比为10：1。

69、进一步，步骤s11中，反应溶液一的浓度为2.5nmol/l。

70、进一步，步骤s12中，荧光适配体为5′-fam-attaaagctcgccatcaaatagc-biotion-3′。

71、采用上述进一步技术方案的有益效果为：荧光基团作用为判断是否有金纳米颗粒链接，金纳米颗粒连接后荧光会淬灭，而金纳米颗粒掉落，荧光会恢复，荧光基团和金纳米颗粒有荧光共振能量转移。

72、进一步，步骤s12中，荧光适配体溶液、二氧化硅磁珠溶液和反应溶液一的体积比为150：1000：350。

73、进一步，步骤s12中，荧光适配体溶液的浓度为100μmol/l。

74、进一步，步骤s12中，二氧化硅磁珠溶液的浓度为500μg/ml。

75、进一步，步骤s12中，采用pbs缓冲液洗涤5次。

76、进一步，步骤s3中，重复冲洗3次。

77、本发明具有以下有益效果：

78、本发明通过二氧化硅磁珠和金纳米颗粒表面适配体的碱基互补配对原则，使两者组装在一起，使二氧化硅磁珠荧光淬灭，得到核心-卫星结构的免疫检测探针。检测时，将待检测的血液加入储液池中，将检测探针加入第二进样口，然后通过手指按压按压腔驱动，将血液过滤完成，过滤后的血液和检测探针通过混合微管道充分混合均匀，流入反应腔，待反应20min后，通过金纳米颗粒表面适配体和抗原之间的特异性结合，血浆中的生物标志物竞争性结合金纳米颗粒，金纳米颗粒则会从磁珠表面游离至血浆中，磁珠则恢复荧光；再次手指按压按压腔，由于磁珠堆积区旁边设置有磁铁，带有荧光的磁珠则停留在磁珠堆积区，用荧光显微镜进行观察，不同浓度生物标志物下光谱强度的变化，而结合生物标志物的金纳米颗粒则流入检测区，该功能区表面带有正电荷，通过正负电性将金纳米颗粒吸附于该功能区中，利用金纳米颗粒自身优异的光学特性在暗场显微镜下观察到的有绿色的斑点，并通过计数实现对生物标志物的检测。

79、1、本发明方法通过手指的按压驱动将血液中的血清分离，并将其和检测探针精准运输在反应腔中，待反应完全后，将磁珠和金纳米颗粒运输至相应的检测区域，通过荧光和暗场显微成像技术对分离的金纳米颗粒进行数学统计，这种方法无需添加信号分子，可以避免对试剂或检测物造成污染，同时对成本和使用方面的要求大幅降低，相比于现有的方法，可以有效提升检测的灵敏度和可靠性。

80、2、本发明所提供的自泵式微流控芯片性质稳定，检测性能好，能够实现对液体的精准运输，将摆脱传统检测的操作繁琐、附加笨重仪器等问题，因其制造结构简单、方便操作、对样本无污染，结合暗场显微镜成像检测技术，可准确的对人全血样本中的前列腺标志物或肿瘤标志物进行过程性判断和定量检测。

81、3、本发明采用特斯拉微阀作为阻尼器，防止了液体的快速回流，通过手指驱动实现了液体的精准运输；本发明设计的自泵式微流控芯片，通过过滤装置可以实现分离、识别、检测为一体的检测体系；本发明设计的检测方法，可以实现双模态的检测，以提高检测的精准度和正确性。

技术特征：

1.一种定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，其特征在于，包括玻璃衬底(1)和盖板(2)，所述盖板(2)设置于玻璃衬底(1)上；所述盖板(2)上设置有依次连通的进样口、功能微管道和出样口(15)；所述进样口和出样口均为为通孔，进样口包括第一进样口(3)、第二进样口(4)和第三进样口(5)；所述功能微管道为凹槽，所述功能微管道设置于靠近玻璃衬底(1)的盖板(2)底部；所述功能微管道包括依次连通的混合微管道、反应腔(9)、分离微管道(10)、检测区(11)、第一特斯拉微阀(12)、按压腔(13)和第二特斯拉微阀(14)；所述混合微管道和进样口连通，所述第二特斯拉微阀(14)和出样口(15)连通；所述分离微管道(10)上连通设置有磁珠堆积区(16)，所述磁珠堆积区(16)旁设置有磁铁放置区(17)；所述第一进样口(3)上设置有储液池(18)，所述储液池(18)底部设置有滤膜(19)；检测区(11)的玻璃衬底(1)表面设置有正电荷。

2.根据权利要求1所述的定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，其特征在于，所述混合微管道包括依次连通的第一微管道(6)、第二微管道(7)和第三微管道(8)，所述第一微管道(6)连通进样口，第二微管道(7)为s型，第三微管道(8)连接反应腔(9)。

3.根据权利要求1所述的定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，其特征在于，所述盖板(2)的材质为聚二甲基硅氧烷。

4.根据权利要求1所述的定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，其特征在于，所述储液池(18)具有进口和出口，所述进口的孔径小于所述出口的孔径，所述进口至所述出口形成流动通道，且所述出口设置有滤膜(19)。

5.权利要求1所述的定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片，其特征在于，反应腔、检测区、按压腔的深度均大于混合微管道、分离微管道、第一特斯拉微阀或第二特斯拉微阀的深度。

6.一种定量检测全血生物标志物的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的定量检测全血生物标志物的自泵式微流控芯片对全血生物标志物进行定量检测。

7.根据权利要求6所述的定量检测全血生物标志物的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的定量检测全血生物标志物的方法，其特征在于，步骤s1中，生物标志物为肿瘤标志物。

9.根据权利要求7所述的定量检测全血生物标志物的方法，其特征在于，步骤s1中，检测探针为荧光适配体修饰的二氧化硅磁珠和核酸适配体修饰的金纳米颗粒的组装体，所述荧光适配体和核酸适配体之间可碱基互补配对，所述核酸适配体和生物标志物之间可特异性识别捕获。

10.根据权利要求7所述的定量检测全血生物标志物的方法，其特征在于，步骤s1中，检测探针通过以下方法制得：

技术总结
本发明公开了一种定量检测全血生物标志物自泵式微流控芯片，涉及暗场显微镜检测肿瘤标志物技术领域。包括玻璃衬底和盖板，盖板上设置有进样口、功能微管道和出样口，功能微管道包括依次连通的混合微管道、反应腔、分离微管道、检测区、第一特斯拉微阀、按压腔和第二特斯拉微阀；分离微管道上连通设置有磁珠堆积区，磁珠堆积区旁设置有磁铁放置区；第一进样口上设置有储液池。本发明所提供的自泵式微流控芯片性质稳定，检测性能好，能够实现对液体的精准运输，将摆脱传统检测的操作繁琐、附加笨重仪器等问题，可准确的对人全血样本中的生物标志物进行过程性判断和定量检测。

技术研发人员：李顺波,赵超山,汪俊菊,王力,徐溢,陈李
受保护的技术使用者：重庆大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23