一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的DNA功能化金纳米棒比色传感器、检测方法及应用
本发明涉及生物，尤其涉及一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器、检测方法及应用。
背景技术：
1、金属汞是一种剧毒的全球性环境污染物。溶剂化汞离子是自然界中主要的稳定形式，其长时间沉积会造成土壤和水域环境的不可逆性污染。汞对人体造成危害主要是通过摄食被汞污染的水源或鱼类，由于汞具有高细胞毒性和显著的生物蓄积性，其能够与含硫的蛋白质和酶结合而造成器官功能障碍和中枢神经系统损伤，即使在极低浓度下也会对人类造成严重的健康损害，通常被认为是毒性最强的重金属污染物之一。中国《食品安全国家标准》规定：生活饮用水中的汞限量为0.001mg/kg，水产动物及其制品中汞含量不得超过0.5mg/kg。因此，样品中汞离子检测技术的开发也随之而来。
2、hg2+定量的常规大型仪器检测技术，例如原子吸收光谱法(aas)、电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)和原子荧光光谱法(afs)被广泛使用，但这些方法需要专业的人员和复杂的操作过程，增加了很多成本，这难以满足社会对实际样品检测的日益增加的需求。近年来新兴的hg2+检测技术主要有电化学和光谱法两大类，但是它们的使用仍对操作人员和实验条件的要求较高，这限制了它们在现场检测中的便携应用。面对以上挑战，目前已有研究利用末端dna存在错配的dsdna-aunps构建了快速比色检测hg2+的方法。尽管它们能够满足可视化、快速、便携的现场检测要求，但是，一方面仍需克服灵敏度低的缺点，另一方面，目前这些金属纳米材料仍属于一次性使用类型，长久以往，可能会对生态环境及自然资源造成不利影响。因此迫切需要开发一种能够可视化、高灵敏、可持续使用的hg2+检测方法，以实现纳米材料的可持续使用，响应可持续发展战略。
3、kanayama等人报道了基于dna-aunps非交联组装检测hg2+方法，其原理是高盐条件下，当末端存在t-t错配的dsdna修饰到aunps上时，由于熵斥力作用使得dsdna-aunps保持分散，溶液颜色为红色。而当体系中存在hg2+时，dsdna末端t-hgii-t结构的形成使得熵斥力减弱，dsdna间的疏水引力使得dsdna-aunps发生组装，溶液由红色变为浅紫色，参见图1。该方法的可视化检测限为0.5微摩尔。该方法虽然可以实现可视化便携检测，但是其灵敏度较低，不能够满足中国《食品安全国家标准》及美国国家环境保护局(epa)对饮用水及水产品中汞含量的限制标准。因此需开发高灵敏度的便携可视化检测方法。
4、luyang wang等人通过加入醇溶剂使得由hg2+引起的聚集的金纳米球表面接枝的dsdna末端打开，通过离心，dna-aunp能够从含有hg2+的纳米废物中回收。并且，将回收的dna-aunps再次应用于hg2+检测，由于不可避免地会残留部分hg2+残基，因此表现出更高的灵敏度。参见图2。此种方法虽然可以提高二次检测hg2+的灵敏度，但是由于引入了外来物质醇溶剂，并且在回收dna-aunps时，无法稳定可控的移除全部醇溶剂，导致二次检测hg2+时的实验条件无法得到稳定的控制，实验重复性无法得到保证。因此需要寻找更为稳定可控的提高dna功能化纳米金比色法检测汞离子灵敏度的可持续使用的方法。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器、检测方法及应用，该dna功能化金纳米棒比色传感器具有检测灵敏度高、可持续检测的特点，检测方法中通过温度调控dsdna-aunrs的状态，实现了对纳米材料的可回收重复利用，且多次重复检测保证了汞离子检测的灵敏度，解决了现有技术中存在的问题。
2、本发明所采用的技术方案之一是：
3、提供了一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，包括修饰hs-dna的金纳米棒aunrs、mis-dna、缓冲液和盐溶液组成的检测体系；mis-dna与hs-dna序列的倒数第二个碱基t-t错配；
4、上述检测体系在高盐浓度下对待测溶液进行一次检测后，采用“升温并离心回收检测体系中的dsdna-aunrs、然后冷却至室温并继续加入前述缓冲液、盐溶液”的方式，实现对多个待测溶液中汞离子的重复、可视化灵敏检测。
5、进一步地，上述提及的升温指升温至35℃-37℃并保持5min，然后离心回收dsdna-aunrs，再冷却至室温进行重复检测。
6、进一步地，升温指升温至35℃并保持5min。
7、进一步地，回收dsdna-aunrs的操作方法为：8000rpm离心2-4min，移除上清液。
8、进一步地，上述检测体系重复检测至少7次，依旧满足对待测溶液中汞离子的可视化灵敏检测；一次检测对待测溶液中汞离子的检测限达18.94nm；多次重复检测的检测限低达3.31nm。
9、进一步地，所述hs-dna序列为：hs-(ch2)6-tacgccaccagctctc，如seq id no1所示；mis-dna序列为：gtgagctggtggcgta，如seq id no2所示；
10、所述检测体系中：hsdna-aunrs终浓度为1.5nm，缓冲液的终浓度为10mm，盐溶液的终浓度为50mm，加入末端错配mis-dna的终浓度为0.9μm；反应10min后加入5m nano3溶液，用于待测溶液中汞离子的检测。
11、进一步地，所述缓冲液为hepes
12、(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，ph 7.4)缓冲液；所述盐溶液为nano3溶液。
13、进一步地，上述检测体系为50μl，加入的5m nano3溶液体积为6.7μl，加入待测溶液量为3.3μl。
14、本发明所采用的技术方案之二是：
15、提供了基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器在汞离子检测中的应用。
16、本发明所采用的技术方案之三是：
17、提供了基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，包括如下操作步骤：
18、(1)hs-dna功能化金纳米棒溶液制备；
19、s1、制备金纳米棒；
20、s2、制备hs-dna功能化金纳米棒溶液；
21、(2)配置检测用反应体系：将步骤(1)制得的hs-dna功能化金纳米棒溶液与hepes缓冲液、nano3盐溶液混合，加入末端错配mis-dna，反应一定时间后继续加入高浓度盐溶液；
22、(3)向步骤(2)反应体系中加入待测溶液，混合并在室温下稳定10min，溶液颜色由蓝绿色变为灰白色，则表明待测溶液中含有汞离子。
23、进一步地，步骤(1)中s1制备金纳米棒操作如下：
24、①晶种种子液制备：将5.0ml 0.5mm的氯金酸溶液加入5.0ml 0.20mctab溶液中，搅拌混合；加快搅拌速度，向混合液中迅速加入600μl 0.01m的冰nabh4，并继续剧烈搅拌2min后停止搅拌，将合成后的溶液保持在25℃备用；
25、②生长液制备：在25℃条件下，将50ml 0.20m ctab溶液加入到2.0ml 0.0040magno3溶液中温和搅拌，向混合溶液中加入50ml 1mm的氯金酸溶液并温和搅拌；然后，逐滴加入700μl 0.0788m抗坏血酸溶液，此时生长溶液颜色从深黄色渐变为无色；
26、将反应温度设置为28℃，向生长液中加入120μl种子液，混匀后静置生长6h以上；反应完成后，将溶液转移至50ml离心管中以9500r/min的条件离心15min，除去上清液后转移剩余液体至15ml离心管中，加超纯水至10ml体积，接着，在8500r/min的条件离心15min，除去上清液，加入适量超纯水，混匀后放入4℃冰箱保存；
27、s2制备hs-dna功能化金纳米棒溶液的操作如下：
28、取2nm的aunrs 200μl，加入还原后的hs-dna，使溶液中hs-dna与aunrs的物质的量比为5000：1，孵育5-7h后加入终浓度为0.01％的十二烷基硫酸钠，静置约1h后，逐步加入硝酸钠溶液，使溶液中硝酸钠的浓度每隔一小时增加至50mm、100mm、150mm、200mm、250mm和300mm，将上述混合溶液孵育过夜；最后以8000r/min的转速离心2次，每次的时长为7min；用适量的超纯水复溶下层沉淀后，测定其可见光谱并计算浓度后在4℃条件下储存备用。
29、进一步地，所述的基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，还包括以下步骤：
30、(4)步骤(3)检测后，将全部溶液升温至35℃-37℃，维持5min，溶液颜色由灰白色变为蓝绿色，回收dsdna-aunrs，冷却至室温，重复步骤(2)中加入hepes缓冲液、nano3盐溶液的步骤，继续用于汞离子二次检测；
31、(5)对检测后溶液，重复步骤(4)中升温-冷却的过程，实现该方法的多次重复检测
32、进一步地，上述方法重复检测数量达7次以上，可用于多个样品的持续检测使用。
33、进一步地，二次检测对汞离子的检测限达12.57nm，多次检测对汞离子的检测限最低达3.31nm。
34、进一步地，步骤(4)中回收dsdna-aunrs的步骤操作为：8000rpm离心2-4min，移除上清液，即得。
35、本发明的有益效果：
36、本发明采用dna功能化金纳米棒比色传感器对汞离子进行检测，相比现有技术，检测灵敏度具有显著提升；同时，利用温度调控检测体系中dsdna-aunrs的状态并通过其与汞离子结合，实现了对汞离子快速、可视化、灵敏检测，检测用样品量少，且可回收金纳米材料并循环使用，用以实现水产品中汞离子的高灵敏、可持续、快速可视化检测，有望将比色检测的灵敏度提高至大型仪器分析的水平，为便携快速检测汞离子提供了新方案，有助于可持续发展目标的实现。
技术特征：
1.一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，其特征在于，包括修饰hs-dna的金纳米棒aunrs、mis-dna、缓冲液和盐溶液组成的检测体系；mis-dna与hs-dna序列的倒数第二个碱基t-t错配；
2.根据权利要求1所述的基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，其特征在于，升温指升温至35℃-37℃并保持5min，然后离心回收dsdna-aunrs，再冷却至室温进行重复检测。
3.根据权利要求1所述的基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，其特征在于，上述检测体系重复检测至少达7次，依旧满足对待测溶液中汞离子的可视化灵敏检测；一次检测对待测溶液中汞离子的检测限达18.94nm；多次重复检测的检测限低达3.31nm。
4.根据权利要求1所述的基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，其特征在于，所述hs-dna序列为：hs-(ch2)6-tacgccaccagctctc；mis-dna序列为：gtgagctggtggcgta；
5.根据权利要求1所述的基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器，其特征在于，所述缓冲液为hepes缓冲液；所述盐溶液为nano3溶液。
6.如权利要求1-5任一所述的基于温度调控的灵敏检测汞离子的dna功能化金纳米棒比色传感器在汞离子检测中的应用。
7.一种基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
8.根据权利要求7所述的基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，其特征在于，二次检测对汞离子的检测限达12.57nm，多次检测对汞离子的检测限最低达3.31nm。
10.根据权利要求8所述的基于温度调控的dna功能化金纳米棒灵敏检测汞离子的方法，其特征在于，步骤(4)中回收dsdna-aunrs的步骤操作为：8000rpm离心2-4min，移除上清液，即得。
技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于温度调控的灵敏检测汞离子的DNA功能化金纳米棒比色传感器、检测方法及应用。该DNA功能化金纳米棒比色传感器包括修饰HS‑DNA的金纳米棒AuNRs、mis‑DNA、缓冲液和盐溶液组成的检测体系；mis‑DNA与HS‑DNA序列的倒数第二个碱基T‑T错配；上述检测体系对待测溶液进行一次检测后，采用升温并离心回收检测体系中的dsDNA‑AuNRs、然后冷却至室温并继续加入缓冲液、盐溶液的方式，实现了对待测溶液中汞离子的多次重复、可视化灵敏检测。
技术研发人员：王国庆,纪迎新,刘丰,沈政
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23