一种单组分TMB显色液及其制备方法与流程
本发明涉及催化，具体涉及一种单组分tmb显色液及其制备方法。
背景技术：
1、tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)是一种新型hrp(辣根过氧化物酶)色原底物。相对其他显色底物，tmb以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为elisa检测的主流显色剂。在elisa检测时，hrp催化过氧化物释放出氧使tmb被氧化成蓝色的产物，加入酸性的终止液终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波长有最大吸收峰。通过测量吸光度，便可定性或定量判断出被检测物的含量。
2、现有市售的酶联免疫试剂盒所采用的tmb显色液大多为双组份，分a液和b液，使用之前需要先混匀，因此存在以下缺点：使用不够方便、提高了包装材料的成本、浪费资源，且使用中的混合过程容易造成批间质量不均一。市售的酶联免疫试剂盒也有采用单组份的tmb显色液，但是现有的单组份tmb显色液存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等问题。
3、研究单组份tmb显色液时，发现在增强其灵敏度和稳定性方面研究比较多，公开号cn105974107a的中国专利文献，公布了采用糖类化合物或其衍生物、缓冲液、二甲基亚砜、tmb、甘油及氧化剂等为主要成分的tmb显色液，通过加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮，解决单组份tmb显色液的稳定性问题，但聚乙烯吡咯烷酮气味较大，在制备过程对环境不友好，不建议大量使用；并且在寻找稳定剂实验的过程中，通过添加稳定剂解决稳定性的同时，显色性能也会出现不同程度地下降，达不到tmb显色液的应用要求。
4、公开号cn111701573b的中国专利文献，公布了采用4-甲基喹啉类物质作为颜色增强剂，可提高tmb显色强度。公开专利cn114324315a的中国专利文献，公布了采用吡啶类化合物可以提高灵敏度。但这些物质均具有一定的刺激气味，且在水溶液中溶解度较差，往往会导致溶液不稳定，从而使得保存时间缩短。
5、因此有必要研究新的显色液，同时解决单组份显色液稳定性差、保存时间短、灵敏度低、显色性能差等问题。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种单组分tmb显色液及其制备方法。本发明所述单组分tmb显色液中加入了兼具稳定剂和增强剂双功能的稳定增强剂金属有机笼mosc-co，其不仅含有芳香结构，又含有特殊的空腔结构，能够对脂溶性的tmb进行包合，从而提高tmb分子的水溶性和稳定性；此外还能作为电子受体接受tmb被氧化释放的电子，从而增强了tmb的显色能力。
2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：
3、本发明的第一个目的在于提供一种单组分tmb显色液，包括以下组分：0.3-0.5g/ltmb、7-25ml/l极性溶剂、0.3-0.6g/l氧化剂、0.1-0.5ml/l抑菌剂、0.05-0.2mol/l缓冲剂、2-10g/l乳化剂、0.2-0.5g/l螯合剂、0.05-1g/l稳定增强剂金属有机笼mosc-co。
4、具体的，所述金属有机笼mosc-co的分子式为c140h132co8o24s8，其对称单元结构如下所示：
5、
6、此处所描述的对称单元结构是指，本发明所述金属有机笼mosc-co是由两个上述对称单元结构相互连接形成。两个对称单元相互连接形成具有特殊的空腔的结构，其不仅含有芳香结构，还能够将脂溶性的tmb包合在内，从而提高了单组分tmb显色液的稳定性，避免了现有技术中出现的稳定性差、保存时间短的问题。
7、本发明所述金属有机笼mosc-co的制备方法参考文献designing structurallytunableandfunctionallyversatilesyntheticsupercontainers(inorg.chem.front.,2015,2,1-6)。
8、具体的，所述金属有机笼mosc-co的制备方法包括如下步骤：
9、s1.将对叔丁基苯酚、硫粉s8和氢氧化钠加入到反应瓶中，再加入四乙二醇二甲醚，氮气保护、230℃下反应7-12h，反应液经后处理得到白色固体4-叔丁基磺酰杯芳烃tbsc；
10、s2.将co(no3)2·6h2o、二苯基甲烷-4,4-二羧酸和tbsc溶于dmf中，将反应瓶置于沙浴中，缓慢升温至100℃，反应24-28h，然后缓慢降温至室温，得到紫红色晶体，经后处理得到金属有机笼mosc-co。
11、优选地，步骤(1)中，所述对叔丁基苯酚、s8和氢氧化钠的投料摩尔比为1:(2-3):(0.5-0.8)，所述后处理为将反应液冷却后，加入甲苯和稀硫酸稀释后，再加入乙醚洗涤，过滤后滤渣用氯仿进行重结晶，得到所述tbsc。
12、优选地，步骤(2)中，所述co(no3)2·6h2o、二苯基甲烷-4,4-二羧酸和tbsc的投料摩尔比为(5-6):(2.2-2.5):1，升温的速率为0.5℃/min，降温的速率为0.2℃/min，所述后处理为将紫红色晶体用甲醇洗涤多次，再在空气中干燥得到所述mosc-co。
13、具体的，所述tmb显色液的ph值为3.5-3.7；例如可以是3.5、3.6或3.7，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。
14、具体的，所述螯合剂为选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸三钠和葡萄糖酸钠中的至少一种；
15、所述氧化剂为选自过氧化脲、过氧化氢和过硼酸钠中的至少一种。
16、具体的，所述极性溶剂为选自dmso、dmf、甘油、乙二醇和乙醇中的至少两种。
17、优选地，所述极性溶剂为dmso和甘油的组合。
18、更为优选地，所述极性溶剂中dmso和甘油的体积比为(4-1):1；例如可以是4:1、3:1、2:1或1:1，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。
19、具体的，所述tmb在所述极性溶剂中的质量体积比为2-4％；例如可以是2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％或4％，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。
20、优选地，所述tmb在所述极性溶剂中的质量体积比为2.5-3％；例如可以是2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3％，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。
21、具体的，所述抑菌剂为选自proclin300、叠氮化钠中的至少一种；
22、所述缓冲剂为选自柠檬酸和柠檬酸钠、柠檬酸和醋酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠中的一种组合；
23、所述乳化剂为非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂，包括吐温20、吐温80、曲拉通x-100、十二烷基硫酸钠和十二烷基磷酸酯钾盐中的至少一种。
24、本发明的第二个目的在于提供一种如上所述单组分tmb显色液的制备方法，包括如下步骤：
25、(1)配制缓冲溶液：加入水和缓冲剂，搅拌至溶解完全，得到缓冲溶液；
26、(2)向所述缓冲溶液中依次加入螯合剂、抑菌剂及乳化剂，充分搅拌均匀得到第一溶液；
27、(3)称取tmb，加入极性溶剂和稳定增强剂mosc-co充分搅拌均匀，得到第二溶液；
28、(4)将所述第二溶液加入所述第一溶液中，混合均匀后，加入所述氧化剂，搅拌均匀至完全溶解并定容，得到第三溶液；
29、(5)将所述第三溶液经微孔滤膜过滤，即得到单组份tmb显色液，避光2-8℃保存。
30、优选地，步骤(3)称取tmb，加入二甲基亚砜，充分溶解后加入mosc-co和甘油充分搅拌均匀，得到第二溶液。
31、与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
32、(1)本发明所述单组分tmb显色液，加入了具有稳定剂功能的包含芳香结构的金属有机笼mosc-co，其包含的特殊的空腔结构能够包合脂溶性的tmb，从而提高了单组分tmb显色液的稳定性；在2-8℃下，该单组分tmb显色液能保存24个月，有效期高达两年；
33、(2)金属有机笼mosc-co还兼具增强剂的功能，其能够作为电子受体接受tmb被氧化释放的电子，从而增强tmb的显色能力；因此该增强剂能够增强信号，提高单组分tmb显色液的灵敏度；
34、(3)本发明稳定增强剂mosc-co具有的多元环结构能够显著加快检测过程时的反应速率，提高单组分tmb显色液的灵敏度；
35、(4)本发明所制备的单组份tmb显色液避免了tmb显色液在使用之间需要将a、b液混合的操作步骤，减少了操作时间，提高了效率，同时避免了因a、b液不同批次间的差异导致混合显色液的显色效果。
技术特征：
1.一种单组分tmb显色液，其特征在于，包括以下组分：0.3-0.5g/ltmb、7-25ml/l极性溶剂、0.3-0.6g/l氧化剂、0.1-0.5ml/l抑菌剂、0.05-0.2mol/l缓冲剂、2-10g/l乳化剂、0.2-0.5g/l螯合剂、0.05-1g/l稳定增强剂金属有机笼mosc-co。
2.根据权利要求1所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述金属有机笼mosc-co的分子式为c140h132co8o24s8，其对称单元结构如下所示：
3.根据权利要求1或2所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述金属有机笼mosc-co的制备方法包括如下步骤：
4.根据权利要求1-3任一项所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述tmb显色液的ph值为3.5-3.7。
5.根据权利要求1-4任一项所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述螯合剂为选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸三钠和葡萄糖酸钠中的至少一种；
6.根据权利要求1-5任一项所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述极性溶剂为选自dmso、dmf、甘油、乙二醇和乙醇中至少两种的组合。
7.根据权利要求6所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述极性溶剂为dmso和甘油的组合；
8.根据权利要求6或7所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述tmb在所述极性溶剂中的质量体积比为2-4％；
9.根据权利要求1-8任一项所述单组分tmb显色液，其特征在于，所述抑菌剂为选自proclin300、叠氮化钠中的至少一种；
10.一种如权利要求1-9任一项所述单组分tmb显色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
技术总结
本发明提供了一种单组分TMB显色液，包括以下组分：0.3‑0.5g/LTMB、7‑25ml/L极性溶剂、0.3‑0.6g/L氧化剂、0.1‑0.5ml/L抑菌剂、0.05‑0.2mol/L缓冲剂、2‑10g/L乳化剂、0.2‑0.5g/L螯合剂、0.05‑1g/L稳定剂金属有机笼MOSC‑Co。本发明加入了兼具稳定剂和增强剂双功能的稳定增强剂金属有机笼MOSC‑Co，其不仅含有芳香结构，又含有特殊的空腔结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性和稳定性；此外还能作为电子受体接受TMB被氧化释放的电子，从而增强了TMB的显色能力。在2‑8℃下，该单组分TMB显色液能保存24个月，有效期高达两年。
技术研发人员：刘飞,李佳,袁永坤
受保护的技术使用者：苏州亚科科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23