一种基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法

本发明属于神经退行性疾病诊断领域，尤其涉及一种基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法。

背景技术：

1、帕金森病(parkinson’s disease,pd)是全球第二大常见中枢神经系统退行性疾病，其核心病理过程是错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein或简称为α-syn)在中脑黑质致密部多巴胺能神经元传播和沉积，造成神经元变性死亡。目前pd的诊断主要基于临床医生对于临床症状的经验性判断，误诊率和漏诊率较高，与其他疾病导致的帕金森综合征难以鉴别。加之pd起病隐匿，而大多数患者在发生pd临床典型症状时中脑多巴胺神经元就已丢失50％以上，使得早期诊断尤为困难。因此，准确有效的早期预测系统对于pd的诊断及鉴别诊断十分必要。

2、α-syn是一种具有自我聚集倾向的蛋白，并且具有与朊蛋白相类似的传播特性。在适当的条件下，错误折叠的α-syn可将正常蛋白转化为错误折叠蛋白，并在细胞间传播。利用这一特性，我们可以将病人体内的错误折叠蛋白呈指数扩增，大大提高诊断的灵敏度和特异度。然而，目前的扩增方法仅限于皮肤、脑脊液样本的扩增，因有创，不宜广泛开展。

3、外泌体是一种由多种细胞分泌的脂质双层膜囊泡，直径在40-100nm之间。研究表明错误折叠的α-syn可以通过外泌体在神经元之间传播，并分泌至外周血中。分泌出的外泌体可以在外周血中稳定存在，随血液循环至全身，并可以在体外通过超速离心的方式富集。外周血诊断pd创伤小，易取样，适宜广泛开展。因此外周血外泌体α-syn的体外扩增技术在pd诊断方面有较大的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本申请实施例的目的是提供一种基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法，技术方案如下：

2、一种基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法，包括：

3、(1)获取待测外泌体样本；

4、(2)制备重组α-突触核蛋白标准品；

5、(3)构建错误折叠蛋白体外扩增反应体系，所述反应体系应以20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液为溶剂，包括体积浓度为5％的待测外泌体样本、终浓度为10μm的tht荧光试剂、终浓度为0.25-1.0mg/ml的重组α-突触核蛋白标准品；

6、(4)将所述反应体系置于恒温振摇仪中进行错误折叠α-突触核蛋白的体外循环扩增。

7、进一步地，所述待测外泌体样本为从血浆中提取的外泌体或从血清中提取的外泌体。

8、进一步地，通过超速离心法从血浆中提取外泌体，包括：

9、(1.1)血浆的采集及预处理：

10、(1.1.1)使用抗凝管采集符合标准的血液样本；

11、(1.1.2)初步离心:将收集到的血液进行离心；

12、(1.1.3)收集血浆:使用移液管收集离心后的上清液，避免扰动底部的细胞沉淀；

13、(1.2)超速离心分离外泌体：

14、(1.2.1)超速离心:将上清液在超速离心机中离心，去除离心上清后，收集沉淀；

15、(1.2.2)使用ripa裂解液将所提取外泌体沉淀超声重悬。

16、进一步地，制备重组α-突触核蛋白标准品，具体为：

17、(2.1)kcm法转化质粒：配制转化体系：0.5体积份的prk172-α-synuclein质粒、10体积份的化学转染试剂、34.5体积份的ddh2o、50体积份的bl21感受态细胞，将所述转化体系置于冰上孵育后室温(20℃-25℃)孵育，于细菌培养板涂板生长，挑出单克隆于细菌培养液中，在摇床进行过夜活化；

18、(2.2)iptg诱导表达：将1体积份的过夜活化的菌液加入1000体积份的细菌培养液中培养，置于摇床，定时检测菌液600nm吸光值od，待od＝0.6-0.8时加入终浓度为1mm的iptg，诱导表达4-16h之后收集菌液样本；

19、(2.3)渗透破碎初步纯化：将表达后的菌液样本置于离心机中5000g离心收集沉淀，加入渗透破碎缓冲液50ml，重悬，配平后使用离心机20000g离心收集沉淀，并配置132g/l终浓度的mg/cl2溶液在冰上进行盐析，充分重悬后，4摄氏度静置5-10min，使用离心机20000g离心，取上清液作为初步纯化样品；

20、(2.4)离子交换：使用8k-14k的透析袋透析所述初步纯化样品至三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液体系中，使用离子交换柱在蛋白液相色谱b进行离子交换，所有样本再进样之前都经过0.22μm滤膜过滤；调低流速为0.1ml/min进行装柱，使用进样泵进样所述初步纯化样本，使用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液洗至基线平稳后开始梯度洗脱，收集不同组分的蛋白溶液，进行蛋白纯度分析，收集90％纯度以上的α-synuclein单体蛋白；

21、(2.5)浓度控制及储存：取上述α-synuclein单体蛋白，使用酶标仪进行蛋白浓度测量，使用浓缩管进行浓缩后用100mm nacl，20mm三羟甲基氨基甲烷的缓冲液稀释至α-synuclein的浓度为5mg/ml；

22、(2.6)制备重组α-突触核蛋白标准品：将浓度为5mg/ml的α-synuclein溶液在恒温振摇仪中以37摄氏度、1000rpm的条件振摇120 -168h。

23、本申请还提供一种帕金森病诊断试剂，所述试剂通过如所述的基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法制备得到。

24、进一步地，所述试剂为制备得到的扩增产物，通过实时检测所述扩增产物的荧光值并计算外泌体中α-突触核蛋白的扩增系数来辅助诊断帕金森病。

25、本申请还提供所述的帕金森病诊断试剂在帕金森病早期诊断中的应用。

26、进一步地，检测扩增系数的试剂包含于标准试剂盒，用于制备扩增反应体系的试剂包含于扩展试剂盒。

27、本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

28、1、本发明提供一种错误折叠α-突触核蛋白体外扩增技术，突破了rt-quic技术瓶颈，成功将错误折叠α-突触核蛋白体外扩增技术应用于血液来源样本，成功通过单次扩增实现血浆外泌体中α-突触核蛋白的高效扩增，实现了该技术由有创向无创发展的突破，为帕金森病的诊断提供一条全新的途径。

29、2、本发明重点关注了pd的诊断与鉴别诊断，发现pd患者血浆外泌体中错误折叠α-突触核蛋白扩增速度显著高于健康人群和pd综合征人群，其诊断灵敏度高、特异度高，可以作为pd诊断的标记物，为诊断和鉴别诊断提供良好依据，能够很好的应用于临床。

30、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

技术特征：

1.一种基于外泌体的错误折叠α-突触核蛋白体外扩增方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测外泌体样本为从血浆中提取的外泌体或从血清中提取的外泌体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过超速离心法从血浆中提取外泌体，包括：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备重组α-突触核蛋白标准品，具体为：

5.一种帕金森病诊断试剂，其特征在于，所述试剂通过如权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到。

6.根据权利要求5所述的帕金森病诊断试剂，其特征在于，所述试剂为制备得到的扩增产物，通过实时检测所述扩增产物的荧光值并计算外泌体中α-突触核蛋白的扩增系数来辅助诊断帕金森病。

7.如权利要求5或6所述的帕金森病诊断试剂在帕金森病早期诊断中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测扩增系数的试剂包含于标准试剂盒，用于制备扩增反应体系的试剂包含于扩展试剂盒。

技术总结
本发明公开了一种基于外泌体的错误折叠α‑突触核蛋白体外扩增方法，突破了RT‑QuIC技术瓶颈，成功将错误折叠α‑突触核蛋白体外扩增技术应用于血液来源样本，成功通过单次扩增实现血浆外泌体中α‑突触核蛋白的高效扩增，实现了该技术由有创向无创发展的突破，为帕金森病的诊断提供一条全新的途径。

技术研发人员：浦佳丽,钟贞,张宝荣,颜轶群,胡晨俊,金艳红,刘天珍
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23