一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液及冻存方法与流程

本发明涉及微藻生物，具体涉及一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液及冻存方法。

背景技术：

1、微藻是一类非常小的光合微生物，通常在显微镜下才能观察到。它们分布广泛，可以在各种自然环境中生存，如淡水和海水、土壤、冰雪，甚至是一些极端环境中。微藻结构简单、繁殖迅速、易于培养、能够产生多种生物活性物质，具有很好的开发前景，以及重要的生态和经济价值。

2、在微藻的研究进程中，微藻的保种是其研发的首要环节。传统微藻保存方式主要为继代保存，如平板、斜面的固体传代或者液体传代。但是，藻类传统的保种方式存在长时间培养容易引起藻种污染、生命力减退以及基因漂变等问题，给藻种的保存、研究以及大规模培养带来众多不便，具体来说，目前藻种保存方法存在以下几方面弊端：(1)遗传稳定性下降：随着传代次数的增加，微藻细胞的遗传稳定性可能会降低，容易发生基因突变，从而影响微藻的生物活性以及生产性状。(2)培养成本增加：如藻种传代需要占用大量空间及设备用于存放藻种；此外，频繁的传代会消耗大量培养基，也耗费人力。这些都会导致培养成本的增加。(3)降低病原体和杂菌污染风险：传代培养过程需要定期划线或者液体传代，过程中如果不严格遵守无菌操作规程，更容易引入病原体和杂菌，影响微藻的健康生长和藻的纯度。

3、微藻玻璃化冻存是一种保存微藻细胞的生物技术方法，它通过快速降温将细胞悬浮在玻璃化溶液中，然后储存在超低温条件下，如-80℃冰箱或液氮冻存。但是目前这种冻存方法仅在莱茵衣藻上有成功的应用，而其他微藻的玻璃化冻存因藻株间差异性不适用该莱茵衣藻的冻存液和冻存方法。该技术的关键在于程序性降温和高效率的冻存液，这样可以最大限度地减少冰晶形成对细胞造成的损伤，有效地保持微藻细胞的活力和遗传稳定性，便于长期保存和运输。此外，玻璃化冻存技术不仅可以克服在藻种多次接种下导致的污染、基因漂变问题，还极大的减少了微藻传代所消耗的人力、物力，从而实现藻种长期保存的目的。目前关于动物细胞玻璃化冻存技术的研究和报道较多，不过动物细胞和微藻细胞由于其细胞结构和微藻细胞存在明显差异、抗冷冻性能、不同通透性保护剂对细胞毒性不同等(影响细胞复苏存活率和增殖活性)，动物细胞的玻璃化冻存液往往不能直接适用于微藻细胞的玻璃化冻存。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液及冻存方法，通过设计冻存液的组成并优化各组分的配比，使得到的冻存液能有效保护藻细胞免受冰晶形成等损伤、维持藻细胞的活性，且适用于各类常见微藻的冻存，拓展了冻存液的适用微藻种类范围。

3、(二)技术方案

4、第一方面，本发明提供一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其由dmem培养基、胎牛血清fbs、dmso、海藻糖、虾青素和水所组成；其中，dmem体积百分比为52-58％，胎牛血清fbs的体积百分比为18-22％，dmso的体积百分比为9-11％；海藻糖的浓度为0-0.05mol/l；虾青素的浓度为0.02-0.2mmol/l。

5、其中，胎牛血清fbs的体积百分比为18-22％，不可过高或过低，其浓度过高时可能会导致细胞应激和营养过剩，其浓度过低时无法为细胞提供足量的营养和保护。

6、dmso为一种渗透保护剂，优选体积浓度为9-11％，其含量不可过高或过低，其含量过高时其较高毒性可能导致蛋白质变性、细胞死亡或功能受损；含量过低时无法有效降低细胞膜的渗透压，导致细胞因冰晶形成而破裂。

7、海藻糖为一种非渗透性保护剂，与微藻细胞具有相容性极好。本发明中，海藻糖的浓度为0-0.05mol/l之间，最小可取零；但实验表明添加有海藻糖得到冻存液的冻存效果优于不含海藻糖的冻存液。不过海藻糖的浓度也不可过高，否则会导致细胞外的渗透压高于细胞内，使得水分从细胞内向细胞外流失，这可能会引起细胞脱水、蛋白质变性和细胞结构损伤。

8、虾青素为一种天然且优异的抗氧化保护剂，其与微藻细胞具有相容性极好，对微藻细胞无任何不良刺激作用。虾青素是一种脂溶性色素，其在水中的溶解性不佳，虾青素浓度达到临界值时继续增加虾青素浓度并不会提高抗氧保护作用反而会增加试剂成本。因此，虾青素在冻存液中的含量也不宜过高，优选是在0.02-0.1mmol/l之间。

9、根据本发明的较佳实施例，所述海藻糖为d-型海藻糖。

10、根据本发明的较佳实施例，海藻糖以海藻糖水溶液加入到冻存液中，海藻糖水溶液浓度为1mol/l，海藻糖水溶液占冻存液体积百分比为0-5％。

11、根据本发明的较佳实施例，虾青素以虾青素水溶液加入到冻存液孩子，虾青素水溶液的浓度为2mmo/l，虾青素水溶液占冻存液体积百分比为1-5％。

12、根据本发明的较佳实施例，所述冻存液中dmem体积百分比为55％，胎牛血清fbs的体积百分比为20％，dmso的体积百分比为10％；海藻糖的浓度为0.05mol/l；虾青素的浓度为0.02mmol/l。

13、第二方面，本发明还提供一种微藻细胞玻璃化冻存方法，其采用上述任一实施例的广谱微藻细胞玻璃化冻存液对藻细胞进行冻存。

14、根据本发明的较佳实施例，所述冻存方法为：将冻存液置于4℃预冷，将生长至对数期的微藻细胞溶液调整至浓度为1×107-1×108/ml得到浓缩藻液；在冻存管中加入浓缩藻液和预冷的冻存液，且藻液体积与冻存液体积比为1：1；放置于梯度降温冻存盒中并转入-80℃超低温冰箱，放置2d；再将冻存管取出，转移至-80℃冰箱或液氮罐中。

15、(三)有益效果

16、采用本发明的微藻细胞玻璃化冻存液所冻存的微藻细胞进行复苏后细胞的存活率高，复苏后藻密度高，细胞增殖情况良好。实验证明，使用本发明的冻存液在-80℃下冻存裸藻细胞5d，恢复7d后裸藻的细胞存活率达到82-98％。

17、本发明的冻存液能够用于冻存包括衣藻、蛋白核小球藻、普通小球藻、佐夫色球藻、盐藻、蓝藻、栅藻、裸藻、裂殖壶藻、鞘丝藻、黄丝藻、紫球藻等在内的多种常见微藻藻种的冻存。实验表明，使用本发明的冻存液在-80℃或液氮中冻存的藻细胞恢复14d后藻细胞密度达初始密度10-25倍，由此证明了本发明的冻存液可适用于多种微藻细胞的冻存且能有效保护藻细胞免受损伤，维持藻细胞的高增殖活性。

技术特征：

1.一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其特征在于，其由dmem培养基、胎牛血清fbs、dmso、海藻糖、虾青素和水所组成；其中，dmem体积百分比为52-58％，胎牛血清fbs的体积百分比为18-22％，dmso的体积百分比为9-11％；海藻糖的浓度为0-0.05mol/l；虾青素的浓度为0.02-0.2mmol/l。

2.根据权利要求1所述的广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其特征在于，所述海藻糖为d-型海藻糖。

3.根据权利要求1所述的广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其特征在于，海藻糖以海藻糖水溶液加入到冻存液中，海藻糖水溶液浓度为1mol/l，海藻糖水溶液占冻存液体积百分比为0-5％。

4.根据权利要求1所述的广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其特征在于，虾青素以虾青素水溶液加入到冻存液孩子，虾青素水溶液的浓度为2mmo/l，虾青素水溶液占冻存液体积百分比为1-5％。

5.根据权利要求1所述的广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其特征在于，所述冻存液中dmem体积百分比为55％，胎牛血清fbs的体积百分比为20％，dmso的体积百分比为10％；海藻糖的浓度为0.05mol/l；虾青素的浓度为0.02mmol/l。

6.一种微藻细胞玻璃化冻存方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的广谱微藻细胞玻璃化冻存液对藻细胞进行冻存。

7.根据权利要求6所述的微藻细胞玻璃化冻存方法，其特征在于，所述冻存方法为：将冻存液置于4℃预冷，将生长至对数期的微藻细胞溶液调整至浓度为1×107-1×108/ml得到浓缩藻液；在冻存管中加入浓缩藻液和预冷的冻存液，且藻液体积与冻存液体积比为1：1；放置于梯度降温冻存盒中并转入-80℃超低温冰箱，放置2d；再将冻存管取出，转移至-80℃冰箱或液氮罐中。

技术总结
本发明涉及一种广谱微藻细胞玻璃化冻存液，其由DMEM培养基、胎牛血清FBS、DMSO、海藻糖、虾青素和水所组成；其中，DMEM体积百分比为52‑58％，胎牛血清FBS的体积百分比为18‑22％，DMSO的体积百分比为9‑11％；海藻糖的浓度为0‑0.05mol/L；虾青素的浓度为0.02‑0.2mmol/L。采用本发明的微藻细胞玻璃化冻存液所冻存的微藻细胞进行复苏后细胞的存活率高，复苏后藻密度高，细胞增殖情况良好，能够用于冻存包括衣藻、蛋白核小球藻、普通小球藻、佐夫色球藻、盐藻、蓝藻、栅藻、裸藻、裂殖壶藻、鞘丝藻、黄丝藻、紫球藻等在内的多种常见微藻藻种的冻存，有效保护藻细胞免受损伤，维持藻细胞的高增殖活性。

技术研发人员：肖奕博,屈玉娇,余丽君,杨愉玲
受保护的技术使用者：深圳元育生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23