鸡球虫核糖体蛋白RPL27和RPP0在鸡球虫耐药性调控中的应用

本发明涉及基因工程领域，特别是关于一种鸡球虫核糖体蛋白rpl27和rpp0在鸡球虫耐药性调控中的应用。

背景技术：

1、自上世纪以来，鸡球虫病在全世界范围内对禽类养殖业造成巨大经济损失，这种由顶复器门、艾美耳属球虫在鸡肠道内不同区域寄生而引起的细胞内寄生虫病，主要表现为损害宿主肠道上皮细胞，导致病鸡营养物质吸收不良、体重减轻、精神萎靡，且伴随着肠道出血，严重时甚至死亡。目前鸡球虫病的防治主要依靠预防用药或活卵囊疫苗(强毒或弱毒疫苗)的免疫预防，但目前由于球虫疫苗存在诸多局限，如疫苗生产成本高昂、物流要求高、稳定性差、保存时间短、不适合大批量生产或毒力返强等原因限制了疫苗的广泛使用，特别是在肉鸡饲养过程中，所以现阶段鸡球虫病的防治仍采用药物预防为主。

2、抗球虫药物主要分为两类：1)化学合成类是由化学合成产生的，具有特定的作用方式，包括抑制寄生虫线粒体的呼吸，代表药为癸氧喹酯；抑制叶酸合成通路，代表药为磺胺药；竞争性抑制硫胺素的摄入，代表药为氨丙啉；其他作用方式的药物有地克珠利、常山酮、尼卡巴嗪等，地克珠利的作用机理普遍认为影响球虫核酸的合成，阻滞裂殖子和小配子细胞正常生长，从而导致生殖失败。2)聚醚类抗生素或离子载体类，由链霉菌属或放线菌属发酵产生，这些药物破坏了寄生虫细胞膜上的离子梯度，主要包括单价离子载体类药，代表药为盐霉素、甲基盐霉素、莫能霉素；二价离子载体类，代表药为拉沙里菌素；单价糖苷离子载体类药，代表药为马杜拉霉素，马杜拉霉素则通过破坏球虫正常的胞内离子平衡，影响na+-k+-atp酶的活性来杀死球虫。长期过量用药的后果迅速体现，球虫已对几乎所有常见药产生了不同程度的耐药性，且愈演愈烈逐渐发展为对多种药物的交叉耐药。随着事态之严重，学者们想探明球虫耐药性是如何产生的，以便能更好的控制球虫病，但至今仍未能破解鸡球虫耐药性产生及发展的谜题。

3、核糖体蛋白在核糖体组装和蛋白质翻译中发挥着至关重要的作用。对顶复门原虫研究发现恶性疟原虫(plasmodium falciparum)核糖体蛋白p2在早期至中期滋养体阶段被排出到被入侵的红细胞表面，人为去除p2后导致疟原虫无法核分裂(das et al.,2021)。弓形虫的核糖体蛋白p2蛋白也被证明与虫体入侵宿主细胞相关(sudarsan et al.,2015)。在同为顶复门原虫的e.tenella中，liang等(2020)发现60s大亚基核糖体蛋白l12(et60s-rpl12)参与球虫入侵宿主细胞，且定位于带虫空泡膜上，说明球虫核糖体蛋白除了组成核糖体参与蛋白质的生物合成外，还可能参与了虫体的入侵、免疫逃避等其他功能。到目前为止，关于鸡球虫核糖体蛋白l27和60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0的研究未见报道，这两个蛋白的特性和功能尚不明确。

技术实现思路

1、为了探究柔嫩艾美耳球虫(e.tenella)耐药产生的确切机制，本团队前期采用药物浓度递增法，以实验室于本世纪初分离保存的e.tenella药物敏感株(ds)为母株，分别传代诱导了e.tenella地克珠利耐药株(dzr)、马杜拉霉素耐药株(mrr)以及盐霉素耐药株(smr)。获得的dzr对1.2mg/kg地克珠利具有完全抗性，mrr对7.0mg/kg马杜拉霉素具有完全抗性，smr对60mg/kg的盐霉素具有完全抗性，且上述实验室诱导的耐药株均能稳定传代。

2、前期通过转录组测序(rna-sequencing，rna-seq)比较了ds、mrr、dzr的差异表达基因，其中e.tenella的核糖体蛋白l27(eth_00024495，etrpl27)、柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0(eth_00038080，etrpp0)，在mrr表达明显不同于ds。在此基础上，本研究对etrpl27和etrpp0特性及功能进行了研究。

3、进一步的，本发明提供一种e.tenella的核糖体蛋白l27(eth_00024495，etrpl27)、柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0(eth_00038080，etrpp0)在艾美耳球虫的耐药性检测中的应用，所述耐药性优选为马杜拉霉素耐药性；

4、进一步的，本申请提供一种可以快速检测球虫耐药性的分子标记，所述分子标记为e.tenella的核糖体蛋白l27(eth_00024495，etrpl27)、柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0(eth_00038080，etrpp0)。

5、进一步的，本申请提供一种分别扩增艾美耳球虫e.tenella的核糖体蛋白l27(eth_00024495，etrpl27)、柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0(eth_00038080，etrpp0)的引物对在制备快速检测球虫耐药性分子标记的试剂盒中的应用；

6、优选的，所述应用为利用pcr检测来测定鸡球虫对马杜拉霉素耐药性，

7、进一步的，所述引物对为etrpl27(rpl27-f：5’-acagggaccttttgttctcg-3’,rpl27-r:5’-tcgtttccagacctttgtcg-3’),etrpp0(rpp0-f：5’-ggcgacagtgctgatgggaaag-3’；rpp0-r:5’-cagaagatgaagccgacgttgagg-3’)。

8、进一步的，本发明提供一种增加艾美耳球虫耐药性的方法，所述方法为在e.tenella体内过表达核糖体蛋白l27和/或60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0，所述耐药性优选为马杜拉霉素耐药性。

9、有益效果

10、etrpl27和etrpp0不仅参与e.tenella核糖体的正常功能——合成蛋白质，还参与了虫体对宿主细胞的入侵过程和虫体对马杜拉霉素耐药性的产生等其他重要的调控功能。球虫耐药性的产生，特别是多重和交叉耐药性的出现，造成许多药物的抗球虫效果不佳，甚至是失效，而新药研发缓慢，因此，导致养鸡场药物的滥用，使动物机体及其产品受到药物残留等污染，也破坏了环境微生态，造成食品安全隐患，威胁到人类的健康。因此，耐药性已成为当前球虫病防控中最主要的障碍，是养殖业健康、可持续性发展的重要阻力。目前球虫耐药性产生的分子机制还不清楚，现有鸡球虫耐药性检测方法为鸡体药物敏感性试验，该方法可以准确检测鸡球虫对药物的敏感性，但需要饲养一定数量的鸡只，费用较高、试验周期比较长、费力、且需要训练良好的专家才能进行判断，很大程度上会导致现场球虫病治疗上的延误。因此，迫切需要建立一种快速、准确检测田间鸡球虫耐药性的方法。

11、本发明的结果为解析球虫对马杜拉霉素产生耐药的分子机制提供基础和球虫耐药性快速分子诊断方法的建立提供技术支撑。

技术特征：

1.一种柔嫩艾美耳球虫(e.tenella)的核糖体蛋白l27，和/或柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0在提高艾美耳球虫的耐药性和/或其抗体抵抗艾美耳球虫入侵中的应用，其特征在于所述耐药性为马杜拉霉素耐药性。

2.一种可以快速检测艾美耳球虫耐药性的分子标记，所述分子标记为e.tenella的核糖体蛋白l27(eth_00024495，etrpl27)，和/或柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0(eth_00038080，etrpp0)，所述耐药性为马杜拉霉素耐药性。

3.一种分别扩增权利要求2所述的分子标记的引物对。

4.如权利要求3所述的引物，其特征在于所述引物具体为：etrpl27(上游引物：5’-gcggaattcatggtcaagctgctcaaacctgga-3’(ecori)；下游引物：r：5’-gcgctcgagttagaatcgcagcttcttgcgaagg-3’(xhoi))；etrpp0(上游引物：5’-cgcgtggatccccggaattcatgttaaagcgattgcca-3’(ecori)；5’-gtcacgatgcggccgctcgaggctcgcagacacccg-3’(xhoi))。

5.权利要求3或4所述的引物在制备快速检测球虫耐药性分子标记的试剂盒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，所述应用为利用pcr检测来测定鸡球虫对马杜拉霉素耐药性。

7.一种增加艾美耳球虫耐药性的方法，其特征在于，所述方法为在e.tenella体内过表达核糖体蛋白l27和/或60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述耐药性为马杜拉霉素耐药性。

9.一种增加艾美耳球虫对抗球虫药马杜拉霉素抗性的方法，其特征在于所述方法为通过抑制艾美耳球虫中核糖体蛋白l27，和/或柔嫩艾美耳球虫60s大亚基酸性核糖体磷酸化蛋白p0的表达。

技术总结
本发明提供一种鸡球虫核糖体蛋白RPL27和RPP0在鸡球虫耐药性调控中的应用，本研究结果表明，本发明的鸡球虫核糖体蛋白RPL27和RPP0可以作为在鸡球虫耐药性检测的一种标志物，而且过表达RPL27和RPP0后的虫株致病性显著增强，对马杜拉霉素耐药性增强。本研究结果为今后筛选抗球虫药物靶标和疫苗分子以及筛选鸡球虫耐药性分子标记建立快速检测田间球虫耐药性方法提供了重要依据，对于绿色生态健康养殖和鸡球虫病防控具有重要意义。

技术研发人员：朱顺海,郭慧琳,韩红玉,赵其平,董辉,谢馨锐,王丽慧,陈烺
受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23