一种融合蛋白及使用其进行大片段DNA定点整合的方法

本发明属于核酸编辑领域，涉及规律成簇的间隔短回文重复(crispr)，尤其涉及融合蛋白及使用其进行大片段dna定点整合的方法。

背景技术：

1、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)由于其安全性，易培养，基因操作容易等特性，长期以来被认为是生产生物燃料、大宗化学品和药物的理想模式微生物。到目前为止，随着合成生物学和代谢工程的快速发展，研究人员已经在酿酒酵母中成功合成了一些高价值天然产物，如托品烷生物碱、大麻素和长春新碱。在酿酒酵母中进行天然产物的生物合成途径涉及复杂的代谢过程，需要表达大量异源基因并精确调控遗传修饰，以确保代谢通量高效地朝向产物合成的方向流动。为了实现异源基因的表达，常用质粒系统或染色体整合方法。然而，质粒的遗传不稳定性可能导致微生物代谢失衡，并且质粒容量有限使得难以表达更多数量甚至数十千碱基团簇上的基因。考虑到遗传稳定性、均匀性和准确拷贝数控制等重要因素，染色体整合正逐渐成为构建细胞工厂首选方法。

2、crispr/cas系统可以高效且精确地在基因组中产生双链断裂(dsbs)。当与酿酒酵母的高效同源重组(hr)机制结合时，该系统可以极大地增强基因组整合的灵活性和效率，加快了细胞工厂的构建。目前在酿酒酵母中已经开发了各种基于crispr/cas的整合方法，包括credit、sgm-crispr、pcr&go和cmi。然而，当前的整合方法受到整合片段长度限制，需要将目的基因分割成多个片段进行顺序整合，从而使整合过程变得复杂。例如，唐等人进行了7次遗传编辑来表达15个异源基因以产生茉莉素；张等人引入了34个来自植物的异源基因，并通过56次遗传编辑来合成长春新碱。这极大地影响了细胞工厂的构建，而大片段dna整合技术可以有效地解决上述挑战。最近，crispr/转座酶系统，如integrate系统和shcast系统，通过将cas9蛋白和转座蛋白连接，利用转座蛋白将待整合的基因片段切割并靶向到dsbs处，已经可以实现在大肠杆菌中高效地整合10kb的dna片段。在酿酒酵母中，di-crispr系统被报道可以在delta位点整合多个24kb的dna片段；i-scei系统将8个的dna片段(共22kb)通过同源重组的方式组装到染色体上。

3、然而上述大片段整合技术存在一定缺陷，如crispr/转座酶系统目前主要在大肠杆菌中应用，能否在真菌中应用尚且未知，而且该系统需要多个表达原件操作繁琐，无法实现无痕整合；di-crispr系统需要引入筛选基因且无法实现定点精确整合；i-scei系统整合效率有限，多个dna片段共组装进染色体时容易发生片段丢失。因此需要更高效、简便、精确定点、无痕的整合技术来实现大片段dna的整合。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种融合蛋白及使用其进行大片段dna定点整合的方法。该融合蛋白构建的crispr-cas9基因编辑系统能够实现高效、简便、精确定点、无痕的大片段dna的整合。

2、本发明的第一个目的是提供融合蛋白，所述融合蛋白包括cas9蛋白、brex27蛋白和fadr蛋白，融合顺序为：cas9-brex27-fadr；

3、作为优选，所述cas9蛋白为seq id no.9的序列；和/或

4、所述brex27蛋白为seq id no.10的序列；和/或

5、所述fadr蛋白为seq id no.11的序列。

6、本发明的第二个目的是提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的融合蛋白；

7、作为优选，所述cas9蛋白的核苷酸序列为序列表seq id no.1；和/或

8、所述brex27蛋白的核苷酸序列为序列表seq id no.5；和/或

9、所述fadr蛋白的核苷酸序列为序列表seq id no.6。

10、本发明的第三个目的是提供一种crispr/cas9基因编辑系统，所述系统在一种或多种载体中包含：

11、a)编码上述融合蛋白的核酸序列；

12、b)编码crispr-cas系统向导rna的核酸序列；

13、作为优选，所述a)和b)的所述核酸在相同或不同的载体上；

14、作为优选，所述向导rna基本上与供体质粒核酸中的靶dna序列杂交。

15、本发明的第四个目的是提供上述的crispr/cas9基因编辑系统在真核表达系统中进行大片段dna定点整合的应用；

16、作为优选，所述真核表达系统包括酿酒酵母；

17、作为优选，所述大片段dna的长度为10kb-40kb。

18、本发明的第五个目的是提供一种大片段dna定点整合方法，包括以下步骤：

19、(1)构建权利要求3所述的crispr/cas9基因编辑系统，所述系统中包括待整合位点的基因；

20、(2)构建供体质粒，所述供体质粒在真核表达系统中无法自我复制；所述供体质粒包括步骤(1)待整合位点的上下游同源臂，以及包括位于上下游同源臂中间的待整合大片段dna序列；所述大片段dna的长度为10kb-40kb；

21、(3)将步骤(1)所述的crispr/cas9基因编辑系统和步骤(2)所述的供体质粒转化入真核表达系统进行表达；

22、作为优选，所述真核表达系统为酿酒酵母。

23、本发明的第六个目的是提供一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

24、(1)构建上述的crispr/cas9基因编辑系统，所述系统中包括xi-3基因；

25、(2)构建供体质粒，所述供体质粒在真核表达系统中无法自我复制；所述供体质粒包括xi-3基因的上下游同源臂，β-胡萝卜素表达途径，以及位于所述上下游同源臂中间的待整合大片段dna序列；所述β-胡萝卜素表达途径包含crte、crtyb、crti和thmg1基因；

26、作为优选，所述上下游同源臂的长度为200-1200bp；优选地，所述上下游同源臂的长度为1000±50bp；

27、作为优选，所述供体质粒为质粒pdonor-xi3；

28、作为优选，所述待整合大片段dna的长度为10kb-40kb；

29、(3)将步骤(1)所述的crispr/cas9基因编辑系统和步骤(2)所述的供体质粒转化入真核表达系统中；

30、作为优选，所述转化为采用醋酸锂/聚乙二醇法(lioac/peg)化学转化法进行转化。

31、作为优选，所述待整合大片段dna序列包括2-12个启动子的结合位点；和/或

32、所述待整合大片段dna序列包括与柠檬酸裂解酶途径和内源的甲羟戊酸合成途径的相关基因；

33、作为优选，所述待整合大片段dna序列包括12个启动子结合位点；

34、作为优选，所述与柠檬酸裂解酶途径和内源的甲羟戊酸合成途径的相关基因包括来自线粒体的丙酮酸转运蛋白(mpc1/mpc3)、柠檬酸和α-酮戊二酸转运蛋白(yhm2)、线粒体内膜柠檬酸转运蛋白(ctp1)、去除过氧化物酶体信号肽的苹果酸脱氢酶(‘mdh3)、胞质nadph特异性异柠檬酸脱氢酶(idp2)、丙酮酸羧化酶(pyc1)、乙酰乙酰辅酶a硫代酶(erg10)、3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶a合酶(erg13)、异戊二烯二磷酸异构酶(idi1)、苹果酸酶(rtme)、柠檬酸裂解酶(mmacl)、ggpp合成酶(crte)、双功能八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶(crtyb)和八氢番茄红素去饱和酶(crti)、内源性截短羟甲酶戊二酰辅酶a还原酶(thmg1)中的至少一种；

35、作为进一步优选，所述与柠檬酸裂解酶途径和内源的甲羟戊酸合成途径的相关基因由以下启动子-终止子组合表达：crtyb基因使用启动子tdh3p和终止子adh1t来表达，crti基因使用启动子tef1p和终止子pyk1t来表达，crte’基因使用启动子tdh3p和终止子adh1t来表达，thmg1基因使用启动子tef1p和终止子pyk1t来表达，’mdh3基因使用启动子tef1p和终止子adh3t来表达，ctp1基因使用启动子adh1p和终止子rps2t来表达，rtme基因使用启动子fba1p和终止子cyc1t来表达，mmacl基因使用启动子tdh3p和终止子tdh1t来表达，mpc1基因使用启动子fba1p和终止子cyc1t来表达，mpc3基因使用启动子adh1p和终止子tdh1t来表达，yhm2基因使用启动子tdh3p和终止子rps2t来表达，pyc1基因使用启动子tpi1p和终止子cyc1t来表达，idp2基因使用启动子pgk1p和终止子pyk1t来表达，erg10基因使用启动子pyk1p和终止子adh1t来表达，erg13基因使用启动子pgk1p和终止子cyc1t来表达，idi1基因使用启动子tdh3p和终止子fba1t来表达。

36、作为优选，当所述待整合大片段dna的长度为10kb-20kb时，所述供体质粒为500-1000ng；

37、当所述待整合大片段dna的长度为20kb-32kb时，所述供体质粒为1000-4000ng；

38、当所述待整合大片段dna的长度为32kb-40kb时，供体质粒为4000-8000ng。

39、本发明的第七个目的是提供一种产β-胡萝卜素基因工程菌，其是由上述的方法构建得到的。

40、本发明的第八个目的是提供一种产β-胡萝卜素的方法，将上述产β-胡萝卜素基因工程菌进行培养，获得β-胡萝卜素。

41、本发明基于crispr/cas9的大片段整合方法cilf(crispr/cas9 basedintegration oflargedna fragments)利用人源的brex27结构域来加强rad51蛋白的招募，从而促进丰富的局部同源重组。此外，它还利用大肠杆菌中的fadr将带有fadr结合位点(bs)的供体质粒靶向递送到cas9产生的dsbs处，从而提高整合效率。利用cilf系统，在酿酒酵母中实现了10kb dna片段的整合，效率为93％，而40kb dna片段(包括16个基因表达盒)的整合效率约为80％。cilf系统在整合大片段dna方面表现出极高的效率，操作灵活简便，并能在目标位点实现精确无痕整合。因此，cilf方法不仅加快了细胞工厂的构建，还丰富了酿酒酵母的合成生物学工具箱。

42、通过crispr/cas9-brex27-fadr系统可以实现高效精准的整合。通过对供体质粒的优化，进一步提升了该系统的整合效率，而且整合片段不易丢失，可以实现无痕整合。仅需要两个质粒，通过醋酸锂化转的方式就能在酿酒酵母中进行大片整合，操作简单。

技术特征：

1.融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括cas9蛋白、brex27蛋白和fadr蛋白，融合顺序为：cas9-brex27-fadr；

2.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的融合蛋白；

3.一种crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于：所述系统在一种或多种载体中包含：

4.权利要求3所述的crispr/cas9基因编辑系统在真核表达系统中进行大片段dna定点整合的应用；

5.一种大片段dna定点整合方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述待整合大片段dna序列包括2-12个启动子的结合位点；和/或

8.根据权利要求6或7所述的一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，其特征在于：当所述待整合大片段dna的长度为10kb-20kb时，所述供体质粒为500-1000ng；

9.一种产β-胡萝卜素基因工程菌，其是由权利要求6-8任一项所述的方法构建得到的。

10.一种产β-胡萝卜素的方法，其特征在于：将权利要求9所述产β-胡萝卜素基因工程菌进行培养，获得β-胡萝卜素。

技术总结
本发明属于核酸编辑领域，提供一种融合蛋白，包括Cas9蛋白、Brex27蛋白和FadR蛋白，包括该融合蛋白的CRISPR‑Cas9基因编辑系统，以及使用该融合蛋白在真核表达系统中进行大片段DNA定点整合的方法。本发明在酿酒酵母中实现了10kb DNA片段的整合，效率为93％，而40kb DNA片段(包括16个基因表达盒)的整合效率约为80％。本发明在整合大片段DNA方面表现出极高的效率，操作灵活简便，并能在目标位点实现精确无痕整合。不仅加快了细胞工厂的构建，还丰富了酿酒酵母的合成生物学工具箱。

技术研发人员：史硕博,徐士杰,刘子鹤
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23