一种高产四氢嘧啶大肠杆菌工程菌株及四氢嘧啶的合成方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高产四氢嘧啶大肠杆菌工程菌株及四氢嘧啶的合成方法。

背景技术：

1、四氢嘧啶，即依克多因，(s)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸，化学结构式如下所示：

2、

3、四氢嘧啶是耐盐微生物在极端环境(如高盐、高温或强紫外线辐射)下赖以生存的重要渗透调节溶质。一经发现就被视为天然润肤剂和蛋白保护剂而应用于化妆品和护肤品中。而且，相关研究表明，四氢嘧啶在治疗艾滋海默症、肺炎和结肠炎等疾病中也有一定的效果。

4、四氢嘧啶最初的批量生产技术是所谓的“细菌挤奶”技术，即利用嗜盐微生物对盐浓度的响应来调控四氢嘧啶的合成和分泌。但是该方法周期长、产量低，容易腐蚀设备，且有大量的高盐废水需要处理。为了开发新的四氢嘧啶合成方法，化学领域和生物领域都掀起了绿色合成四氢嘧啶的浪潮。

5、专利cn 101698662以昂贵的l-2,4-二氨基丁酸为原料通过两步化学法合成四氢嘧啶(合成路线如附图5所示)。而专利cn 108003105则利用价格低廉的乙酰天冬酰胺为原料，经过多步化学反应(内酰胺化、基团保护、羰基还原、酰胺水解、氨基脱保护、盐酸盐化和成环等步骤)合成四氢嘧啶(合成路线如附图6所示)，但是该路线步骤繁琐，原子经济性差，存在副产物和不利于下游分离等问题。

6、相较而言，生物法(包括酶催化法和发酵法)则因为其温和的条件和高立体选择性显得更为经济环保。专利cn 116769813a以大肠杆菌w3110为底盘细胞，在基因组上敲除crr基因，强表达galp和glk基因，并利用启动子pycig调控四氢嘧啶合成基因簇的表达，获得的基因工程菌经过62h发酵四氢嘧啶产量达36g/l。专利cn 107142234利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶，通过过表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶基因lyscfbr和弱化二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达来提高重组谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶的产量，经72h的发酵积累12g/l的四氢嘧啶。专利cn 111394288也是将外源的四氢嘧啶合成基因簇转入经基因组改造的谷氨酸棒杆菌，发酵70h积累约25g/l的四氢嘧啶。

7、目前，利用大肠杆菌bl21(de3)为底盘细胞的四氢嘧啶生产菌株主要以过表达功能性基因为主，极少涉及到底盘细胞的基因组编辑。为此，本发明结合蛋白质工程和代谢工程策略，提供一种高产四氢嘧啶大肠杆菌工程菌株，以实现四氢嘧啶的高产从头(葡萄糖)合成。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明结合蛋白质工程和代谢工程策略，以大肠杆菌e.colibl21(de3)为底盘细胞，过表达l-2,4二氨基丁酸转氨酶(ectb)或其突变体、二氨基丁酸乙酰转移酶(ecta)、四氢嘧啶合成酶(ectc)和抗反馈抑制的天冬氨酸激酶(lyscfbr)等编码基因，并将基因组中的天冬氨酸氨裂解酶aspa基因进行强表达，最终实现四氢嘧啶的高效从头合成。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种ectb突变体，所述ectb突变体的突变方式为在如seq id no.1所示的氨基酸序列上进行f137y、h138s、h138a、a365k、t111s、t111a中任意一种或两种氨基酸残基突变。其中，突变体格式xny，x代表原始氨基酸残基，n代表所述序列seq id no.1的突变位点，y为突变后氨基酸残基。

4、作为一种较优的实施方式，优选的，所述ectb突变体的突变方式为在如seq idno.1所示的氨基酸序列上进行h138s/t111a两点的氨基酸残基突变。

5、本发明还提供一种高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，所述重组大肠杆菌为e.colibl21(de3)基因编辑菌株；

6、所述重组大肠同时过表达ectb或上述ectb突变体、ecta、ectc和lyscfbr，并对底盘细胞e.coli bl21(de3)中的天冬氨酸氨裂解酶基因apsa进行强表达。

7、作为一种可能的实施方式，进一步，所述ectb包含seq id no.1所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.1所示的氨基酸序列同源性高于90％的多肽蛋白；

8、所述ecta包含seq id no.2所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.2所示的氨基酸序列同源性高于90％的多肽蛋白；

9、所述ectc包含seq id no.3所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.3所示的氨基酸序列同源性高于90％的多肽蛋白；

10、所述lyscfbr包含seq id no.4所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.4所示的氨基酸序列同源性高于90％的多肽蛋白。

11、作为一种可能的实施方式，进一步，在大肠杆菌的细胞中，利用双质粒表达系统进行外源基因ectb或上述ectb突变体、ecta、ectc和lyscfbr的过表达。

12、作为一种可能的实施方式，进一步，所述双质粒表达系统包括重组质粒pet30a-ectbac与重组质粒pcdf-ectac-lyscfbr；

13、所述重组质粒pet30a-ectbac的构建方法为：在pet30a的启动子下游重组ectb或上述的ectb突变体、ecta和ectc的编码基因，构建重组质粒pet30a-ectbac；

14、所述重组质粒pcdf-ectac-lyscfbr的构建方法为：在pcdfduet-1的第一个启动子的下游重组ecta和ectc的编码基因，同时在第二个启动子的下游重组lyscfbr的编码基因，构建重组质粒pcdf-ectac-lyscfbr。

15、作为一种可能的实施方式，进一步，所述ectb、ecta、ectc和lyscfbr的编码基因分别如seq id no.5-8所示。

16、作为一种可能的实施方式，进一步，所述e.coli bl21(de3)中天冬氨酸氨裂解酶基因apsa进行强表达的方式为：

17、通过添加启动子ptrc实现天冬氨酸氨裂解酶基因aspa的强表达，获得基因编辑菌株e.coli bl21(de3)-ptrc-aspa。

18、作为一种可能的实施方式，进一步，将重组质粒pet30a-ectbac或突变体质粒和pcdf-ectac-lyscfbr转化至基因编辑菌株e.coli bl21(de3)-ptrc-aspa的感受态细胞中。

19、本发明还提供一种四氢嘧啶的合成方法，以葡萄糖为原料，乳糖或iptg为诱导剂，通过上述大肠杆菌工程菌株发酵合成四氢嘧啶。

20、上述大肠杆菌工程菌株发酵合成四氢嘧啶的反应条件为：发酵过程中控制ph为6.9-7.1，诱导前温度设为37℃，诱导后温度设为25℃，溶氧水平控制在15-30％，并流加葡萄糖控制残糖浓度为0.1-1g/l。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、本发明采用微生物发酵的方法，以e.coli bl21(de3)为底盘细胞，组合蛋白质工程和代谢工程策略，构建四氢嘧啶高产菌株e.coli bl21(de3)-ptrc-aspa(pet30a-ectbh138s/t111aac+pcdf-ectac-lyscfbr)。该菌株在发酵合成四氢嘧啶的过程中兼具高产量和高葡萄糖转化率，能够以葡萄糖为原料，从头高效合成四氢嘧啶，在5l生物反应器中发酵75h，产量达到103g/l，时空产率为1.37g/(l·h)，葡萄糖转化率为0.35g/g，具有菌种改造简单、时空产率高、原子经济性高、发酵成本低和绿色环保等优势。

技术特征：

1.一种ectb突变体，其特征在于，所述ectb突变体的突变方式为在如seq id no.1所示的氨基酸序列上进行f137y、h138s、h138a、a365k、t111s、t111a中任意一种或两种氨基酸残基突变。

2.根据权利要求1所述的l-2,4二氨基丁酸转氨酶突变体，其特征在于，所述ectb突变体的突变方式为在如seq id no.1所示的氨基酸序列上进行h138s/t111a两点的氨基酸残基突变。

3.一种高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为e.colibl21(de3)基因编辑菌株；

4.根据权利要求3所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述ectb包含seq id no.1所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.1所示的氨基酸序列同源性高于90％的多肽蛋白；

5.根据权利要求3所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌的细胞中，利用双质粒表达系统进行外源基因ectb或如权利要求1所述的ectb突变体、ecta、ectc和lyscfbr的过表达。

6.根据权利要求5所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述双质粒表达系统包括重组质粒pet30a-ectbac与重组质粒pcdf-ectac-lyscfbr；

7.根据权利要求6所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述ectb、ecta、ectc和lyscfbr的编码基因分别如seq id no.5-8所示。

8.根据权利要求6所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述e.colibl21(de3)中天冬氨酸氨裂解酶基因apsa进行强表达的方式为：

9.根据权利要求8所述的高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，将重组质粒pet30a-ectbac或突变体质粒和pcdf-ectac-lyscfbr转化至基因编辑菌株e.coli bl21(de3)-ptrc-aspa的感受态细胞中。

10.一种四氢嘧啶的合成方法，其特征在于，以葡萄糖为原料，乳糖或iptg为诱导剂，通过如权利要求9所述的大肠杆菌工程菌株发酵合成四氢嘧啶。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高产四氢嘧啶大肠杆菌工程菌株及四氢嘧啶的合成方法。本发明利用双质粒系统将L‑二氨基丁酸转氨酶(EctB)或其突变体、二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)、四氢嘧啶合成酶(EctC)和解除反馈抑制的天冬氨酸激酶(LysC<supgt;fbr</supgt;)等编码基因在大肠杆菌基因编辑菌株(E.coli BL21(DE3)‑P<subgt;trc</subgt;‑aspA)中过表达，构建了一株兼具高四氢嘧啶产量和高葡萄糖转化率的大肠杆菌工程菌株。该菌株在5L分批补料发酵中，可以以葡萄糖为碳源从头合成四氢嘧啶，经过75h发酵积累103g/L的四氢嘧啶，时空产率达1.37g/L/h，葡萄糖的转化率高达0.35g/g。

技术研发人员：林娟,苏冰梅,杨雯
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23