一种磷酸胆碱胞苷转移酶及其应用的制作方法
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种磷酸胆碱胞苷转移酶及其应用。
背景技术：
1、胞磷胆碱是一种核苷衍生物，是磷脂酰胆碱合成的重要前体，磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分，对于稳定细胞区室化、刺激受损神经元细胞膜的修复和再生等具有重要的作用。另外，胞磷胆碱也是乙酰胆碱的前体物质，可以促进乙酰胆碱的合成，具有改善脑功能，促进脑细胞修复，缓解脑供血不足，增强记忆力，改善睡眠质量，减轻头痛等作用。
2、目前胞磷胆碱的合成方法有化学法、发酵法和酶催化法。化学法底物转化率低，反应过程复杂，会使用到有毒的化学试剂，不利于扩大规模生产。发酵法主要是利用酵母体内的酶系和atp合成胞磷胆碱，反应虽然温和，但产物浓度不高，转化率低，而且分离困难。近几年来，生物工作者开发了以胞苷和氯化胆碱为底物，以乙酰磷酸和乙酸激酶进行atp能量循环的多酶催化工艺来合成胞磷胆碱，具体的反应路径如图1所示。该方法原料成本低，但研究表明磷酸胆碱胞苷转移酶(cct酶)是合成胞磷胆碱的关键限速酶，用于atp循环再生的乙酰磷酸盐的积累也会抑制该酶的催化活性，导致转化效率低。因此提高磷酸胆碱胞苷转移酶的活性，对胞磷胆碱的合成具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种活性更高的磷酸胆碱胞苷转移酶。
2、本发明还要解决的技术问题是提供上述磷酸胆碱胞苷转移酶在催化反应制备胞磷胆碱中的应用。
3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
4、一种磷酸胆碱胞苷转移酶，所述的磷酸胆碱胞苷转移酶的氨基酸序列，是将野生型磷酸胆碱胞苷转移酶的第31位赖氨酸突变为谷氨酸，第34位异亮氨酸突变为谷氨酸，第94位丙氨酸突变为谷氨酸，第129位天冬酰胺突变为天冬氨酸得到的。
5、其中，所述的野生型磷酸胆碱胞苷转移酶来源于肺炎链球菌streptococcuspneumoniae，其氨基酸序列如seq id no.1所示，对应的编码野生型磷酸胆碱胞苷转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、其中，所述的磷酸胆碱胞苷转移酶，其氨基酸序列如seq id no.3所示，对应的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、其中，所述的磷酸胆碱胞苷转移酶经氨基酸位点改造后，其活性得到了显著的提高，酶活力约是野生型磷酸胆碱胞苷转移酶的3.53倍。
8、具体的，所述的酶活定义为每分钟产生1μmol胞磷胆碱所需的酶量，按每g湿菌体计算酶活单位。
9、上述野生型磷酸胆碱胞苷转移酶和氨基酸改造后的磷酸胆碱胞苷转移酶的基因序列均委托通用生物(安徽)股份有限公司进行全基因合成，为了便于后续克隆，基因片段5′端增加catatg六个碱基，形成ndei酶切位点，3′端增加ctcgag六个碱基，形成xhoi酶切位点。
10、一种含有上述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因核苷酸序列的重组表达载体也在本发明所保护的范围之内。
11、其中，所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的磷酸胆碱胞苷转移酶基因的核苷酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述的重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达所述的磷酸胆碱胞苷转移酶即可。
12、在本发明的一些实施例中，所述的市售空载载体为针对宿主大肠杆菌bl21(de3)的pet28a载体。
13、一种含有上述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因核苷酸序列或含有上述重组表达载体的重组菌株也在本发明所保护的范围之内。
14、上述磷酸胆碱胞苷转移酶在催化反应制备胞磷胆碱中的应用也在本发明所保护的范围之内。
15、其中，所述的催化反应过程分为两步进行，第一步是以胞苷为底物，atp为辅助底物，通过尿苷激酶和乙酸激酶催化胞苷合成胞苷酸反应液；第二步是以胞苷酸反应液、氯化胆碱为底物，通过乙酸激酶、胞苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶催化合成胞磷胆碱。
16、具体的，所述的乙酸激酶为ack，所述的尿苷激酶为udk，胞苷酸激酶为cmk，核苷二磷酸激酶为ndk，胆碱激酶为cki。
17、具体的，所述第一步，其催化反应体系包括：10-80mm胞苷、1-10mm atp、5-50mm氯化镁、50-100mm乙酰磷酸、0.5-2g/l乙酸激酶、1-10g/l尿苷激酶；其反应条件为：35-40℃，ph＝7.0-8.0条件下反应2-5h。优选的，反应条件为：反应温度维持在37℃，反应时间2～3小时，ph 7.5。
18、具体的，所述第二步，其催化反应体系包括：10-80mm胞苷酸反应液、10-85mm氯化胆碱、10-150mm氯化镁、50-350mm乙酰磷酸、0.2-2g/l乙酸激酶、1-10g/l胞苷酸激酶、0.5-2g/l核苷二磷酸激酶、1-5g/l胆碱激酶和1-10g/l磷酸胆碱胞苷转移酶；其反应条件为：35-40℃，ph＝7.0-8.0条件下反应12-18h。优选的，反应条件为：反应温度维持在37℃，反应时间16小时，ph 7.5。
19、有益效果：本发明通过对肺炎链球菌streptococcus pneumoniae来源的野生型磷酸胆碱胞苷转移酶进行定点改造，获得了一种活性得到显著提高的磷酸胆碱胞苷转移酶，其酶活力是野生型磷酸胆碱胞苷转移酶的3.53倍。在本发明中利用该高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶催化生产胞磷胆碱，胞磷胆碱的浓度得到了显著提高，转化效率也大大提高。因而，本发明定点改造得到的磷酸胆碱胞苷转移酶具有极高的催化应用潜力，在工业应用中具有广阔的应用前景。
技术特征：
1.一种磷酸胆碱胞苷转移酶，其特征在于，所述磷酸胆碱胞苷转移酶的氨基酸序列是将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型磷酸胆碱胞苷转移酶进行点突变得到的；其中，所述的点突变位点为第31位、第34位、第94位和第129位。
2.根据权利要求1所述的磷酸胆碱胞苷转移酶，其特征在于，所述点突变具体是将野生型磷酸胆碱胞苷转移酶的第31位赖氨酸突变为谷氨酸，第34位异亮氨酸突变为谷氨酸，第94位丙氨酸突变为谷氨酸，第129位天冬酰胺突变为天冬氨酸。
3.根据权利要求1所述的磷酸胆碱胞苷转移酶，其特征在于，所述磷酸胆碱胞苷转移酶，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
4.编码权利要求3所述的磷酸胆碱胞苷转移酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3所述磷酸胆碱胞苷转移酶的核苷酸序列。
6.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求3所述磷酸胆碱胞苷转移酶的核苷酸序列或含有权利要求5所述重组表达载体。
7.权利要求1-3中任意一项所述的磷酸胆碱胞苷转移酶在催化反应制备胞磷胆碱中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应的过程分为两步进行，第一步是以胞苷为底物，atp为辅助底物，通过尿苷激酶和乙酸激酶催化胞苷合成胞苷酸反应液；第二步是以所述的胞苷酸反应液、氯化胆碱为底物，通过乙酸激酶、胞苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和权利要求1所述的磷酸胆碱胞苷转移酶催化合成胞磷胆碱。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第一步，其催化反应体系包括：10-80mm胞苷、1-10mm atp、5-50mm氯化镁、50-100mm乙酰磷酸、0.5-2g/l乙酸激酶、1-10g/l尿苷激酶；其反应条件为：35-40℃，ph＝7.0-8.0下反应2-5h。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第二步，其催化反应体系包括：10-80mm胞苷酸反应液、10-85mm氯化胆碱、10-150mm氯化镁、50-350mm乙酰磷酸、0.2-2g/l乙酸激酶、1-10g/l胞苷酸激酶、0.5-2g/l核苷二磷酸激酶、1-5g/l胆碱激酶和1-10g/l磷酸胆碱胞苷转移酶；其反应条件为：35-40℃，ph＝7.0-8.0下反应12-18h。
技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种磷酸胆碱胞苷转移酶及其应用。本发明基于肺炎链球菌来源(Streptococcus pneumoniae)的野生型磷酸胆碱胞苷转移酶CCT([EC:2.7.7.15])的氨基酸进行改造，通过将野生型磷酸胆碱胞苷转移酶的第31位赖氨酸突变为谷氨酸，第34位异亮氨酸突变为谷氨酸，第94位丙氨酸突变为谷氨酸，第129位天冬酰胺突变为天冬氨酸，获得了一种具有更高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶。利用该高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶催化胞苷和氯化胆碱生产胞磷胆碱，有效提高了转化效率，具有重要的工业应用前景。
技术研发人员：应汉杰,陈勇,王骏之,王金辉,温庆仕,刘庆国
受保护的技术使用者：江苏集萃工业生物技术研究所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23