一种替尔泊肽的制备方法与流程
本发明涉及药品，具体涉及一种替尔泊肽的制备方法。
背景技术：
1、替尔泊肽(tirzepatide)是礼来的2型糖尿病多肽药物，是一种glp-1(胰高血糖素样肽-1)/gip(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)受体共激动剂。它通过每周一次皮下注射给药，进而达到控制血糖的目标。替尔泊肽附有c20脂肪酸二酸部分，用于优化化合物的摄取和代谢。c20脂肪酸二酸部分(二十烷二酸)通过谷氨酸和两个(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸单元，连接到赖氨酸残基的侧链上，这个脂质化的修饰使得替尔泊肽的半衰期延长至5天左右，并延长了剂量之间的时间。
2、fda(食品药品监督管理局)于2023年5月批准了替尔泊肽用于治疗2型糖尿病，药品名为mounjaro(替尔泊肽的商品名)。fda于2023年11月批准了替尔泊肽注射液用于减肥，药品名为zepbound(替尔泊肽的商品名)，可通过抑制食欲和延缓胃排空进行减肥，患者使用替尔泊肽后平均可减轻15％-20％的体重。
3、替尔泊肽的结构如下：
4、tyr1-aib-glu-gly-thr5-phe-thr-ser-asp-tyr10-ser-ile-aib-leu-asp15-lys-ile-ala-gln-lys20(aeea-aeea-γglu-eicosanedioicacid)-ala-phe-val-gln-trp25-
5、leu-ile-ala-gly-gly30-pro-ser-ser-gly-ala35-pro-pro-pro-ser-nh2
6、现有技术中公开了
7、中国专利cn114736271a公开了一种tirzepatide的制备方法，包括如下步骤：步骤一，tirzepatide序列的第7-8位氨基酸，第10-11位氨基酸，第32-33位氨基酸，作为伪脯二肽；第29-30位氨基酸作为二肽；步骤二，在反应溶剂中用缩合剂按顺序依次固相合成tirzepatide序列的其他位点氨基酸，使用fmoc脱除试剂合成全保护tirzepatide；步骤三，采用裂解试剂进行裂解沉淀，得到tirzepatide。采用该方法制备时，粗肽收率较低，不利于大规模生产。
技术实现思路
1、针对现有技术中替尔泊肽粗肽收率较低的问题，本发明提供了一种替尔泊肽的制备方法。
2、为实现上述技术目的，本发明提供了一种替尔泊肽的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、在第一树脂上通过固相合成法依次偶联氨基酸衍生物r1-ser(r2)-oh、r1-pro-oh、r1-pro-oh、r1-pro-oh、r1-ala-oh、r1-gly-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-pro-oh、r1-gly-oh、r1-gly-oh、r1-ala-oh、r1-ile-oh、r1-leu-oh、r1-trp(r2)-oh、r1-gln(r2)-oh、r1-val-oh、r1-phe-oh、r1-ala-oh、替尔泊肽侧链、r1-gln(r2)-oh、r1-ala-oh、fmoc-ile-oh、r1-lys(r2)-oh、r1-asp(r2)-oh，得到偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂；
4、s2、在第二树脂上通过固相合成法依次偶联氨基酸衍生物r1-leu-oh、r1-aib-oh、r1-ile-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-tyr(r2)-oh、r1-asp(r2)-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-thr(r2)-oh、r1-phe-oh、r1-thr(r2)-oh、r1-gly-oh、r1-glu(r2)-oh，得到偶联氨基酸衍生物3-14aa的肽树脂，再经裂解肽树脂得到r1-(3-14aa)-oh；或者，在第二树脂上通过固相合成法依次偶联氨基酸衍生物r1-leu-oh、r1-aib-oh、r1-ile-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-tyr(r2)-oh、r1-asp(r2)-oh、r1-ser(r2)-oh、r1-thr(r2)-oh、r1-phe-oh、r1-thr(r2)-oh，得到偶联氨基酸衍生物5-14aa的肽树脂，再经裂解肽树脂得到r1-(5-14aa)-oh；
5、s3、在偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂上通过固相合成法依次偶联氨基酸衍生物r1-(3-14aa)-oh、r1-tyr(r2)-aib-oh，得到替尔泊肽肽树脂；或者，在偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂上通过固相合成法依次偶联r1-(5-14aa)-oh、r1-gly-oh、r1-glu(r2)-oh、r1-tyr(r2)-aib-oh，得到替尔泊肽肽树脂；
6、s4、将替尔泊肽肽树脂裂解肽树脂和保护基得到替尔泊肽；
7、所述r1为氨基保护基，r2为氨基酸的侧链保护基。
8、所述替尔泊肽侧链为fmoc-lys20(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioicacid(mono-tbu))-oh。
9、所述偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂为r1-asp(r2)-lys(r2)-ile-ala-gln(r2)-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic acid(mono-tbu))-ala-phe-val-gln(r2)-trp(r2)-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser(r2)-ser(r2)-gly-ala-pro-pro-pro-ser(r2)-rink amide am-resin。
10、所述偶联氨基酸衍生物3-14aa的肽树脂为r1-glu(r2)-gly-thr(r2)-phe-thr(r2)-ser(r2)-asp(r2)-tyr(r2)-ser(r2)-ile-aib-leu-ctc resin。
11、所述r1-(3-14aa)-oh为r1-glu(r2)-gly-thr(r2)-phe-thr(r2)-ser(r2)-asp(r2)-tyr(r2)-ser(r2)-ile-aib-leu-oh。
12、所述偶联氨基酸衍生物5-14aa的肽树脂为r1-thr(r2)-phe-thr(r2)-ser(r2)-asp(r2)-tyr(r2)-ser(r2)-ile-aib-leu-ctc resin。
13、所述r1-(5-14aa)-oh为r1-thr(r2)-phe-thr(r2)-ser(r2)-asp(r2)-tyr(r2)-ser(r2)-ile-aib-leu-oh。
14、所述替尔泊肽肽树脂为r1-tyr(r2)-aib-glu(r2)-gly-thr(r2)-phe-thr(r2)-ser(r2)-asp(r2)-tyr(r2)-ser(r2)-ile-aib-leu-asp(r2)-lys(r2)-ile-ala-gln(r2)-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic acid(mono-tbu))-ala-phe-val-gln(r2)-trp(r2)-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser(r2)-ser(r2)-gly-ala-pro-pro-pro-ser(r2)-rink amide am-resin。
15、进一步地，s1步骤中，所述偶联之前还包括采用脱保护剂对第一树脂进行脱保护；优选的，所述脱保护剂选自哌啶溶液、吗啉溶液、二乙胺溶液、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯溶液、四氢吡咯溶液、哌嗪溶液中的至少一种；优选的，所述第一树脂与脱保护剂的质量体积比为1g:5-15ml；更优选的，所述哌啶溶液中的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；更优选的，所述哌啶溶液中哌啶的体积百分浓度为15-35％。
16、进一步地，s1、s2或s3步骤中，采用含氨基酸衍生物与树脂在缩合剂的存在下进行偶联；优选的，所述缩合剂选自n,n’-二异丙基碳二亚胺、n,n-二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、三乙胺中的至少一种；优选的，所述氨基酸衍生物和缩合剂的摩尔比为1:1-3；优选的，所述氨基酸衍生物与树脂的摩尔比为1-5:1；优选的，所述偶联的温度为0-35℃，时间为0.5-16h。
17、进一步地，所述偶联的反应体系中还包括催化剂；优选的，所述催化剂为1-羟基苯并三唑；优选的，所述缩合剂与催化剂的摩尔比为1-2:1-2。
18、所述混合液中的溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜、n-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
19、进一步地，s2步骤或者s4步骤中，采用裂解液裂解肽树脂和/或保护基；优选的，所述第二树脂或替尔泊肽肽树脂与裂解液的质量体积比为1g:5-25ml；优选的，所述裂解的温度为20-28℃；优选的，所述裂解的时间为2-5h；优选的，所述裂解液为由三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇中的至少一种与溶剂的混合液；更优选的，所述混合液中溶剂选自二氯甲烷或水。
20、s2步骤中，所述裂解液为体积比为1:3-5的三氟乙醇和二氯甲烷。
21、s4步骤中，所述裂解液为体积比为92-96:2-3:2-3的三氟乙酸、三异丙基硅烷和水。
22、进一步地，所述氨基保护基为c1-c16的烷氧羰基类保护基；优选的，所述c1-c16的烷氧羰基类保护基选自叔丁氧羰基或9-芴甲氧羰基。
23、进一步地，所述氨基酸的侧链保护基选自c1-c16的烷氧羰基类保护基、c4-c21的烷基类保护基、c4-c8的烷氧基类保护基中的至少一种；优选的，所述c1-c16的烷氧羰基类保护基为叔丁氧羰基；优选的，所述c4-c21的烷基类保护基选自叔丁基、三苯甲基中的至少一种；优选的，所述c4-c8的烷氧基类保护基为叔丁氧基。
24、进一步地，所述第一树脂为(氨甲基)聚苯乙烯树脂；和/或，所述第二树脂为2-氯三苯甲基氯聚苯乙烯树脂；和/或，所述偶联前还包括采用洗涤剂对第一树脂进行洗涤和/或溶胀的步骤；和/或，s2步骤或者s3步骤中，所述偶联结束后还包括采用收缩剂对偶联后的产物进行收缩。
25、所述洗涤剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲基亚砜、n-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
26、所述收缩剂选自无水甲醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚中的至少一种。
27、进一步地，所述替尔泊肽的制备方法中还包括对替尔泊肽进行纯化和干燥的步骤；优选的，所述纯化的步骤包括，(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对含替尔泊肽的溶液进行第一次纯化，收集纯化后的流出液；(2)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以碳酸氢铵水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对第一次纯化后的流出液进行第二次纯化。
28、进一步地，所述三氟乙酸水溶液的体积百分浓度为0.05-0.20％；和/或，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为5-50mmol/l；和/或，所述含替尔泊肽的溶液中的溶剂为体积百分浓度为30-40％的三氟乙酸水溶液；和/或，所述第二次纯化后还包括调节流出液的ph为7.8-8.2。
29、本发明的技术方案具有以下有益效果：
30、(1)本发明提供的一种替尔泊肽的制备方法，包括，分别制备偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂、r1-(3-14aa)-oh片段或者r1-(5-14aa)-oh片段；然后在偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂上采用固相合成的方法依次偶联r1-(3-14aa)-oh、r1-tyr(r2)-aib-oh，或者，在偶联氨基酸衍生物15-39aa的肽树脂上采用固相合成的方法依次偶联r1-(5-14aa)-oh、r1-gly-oh、r1-glu(r2)-oh、r1-tyr(r2)-aib-oh，最后裂解肽树脂和保护基得到替尔泊肽。采用本发明的制备方法，不仅提高了替尔泊肽的纯度和收率，还缩短了制备周期。
31、(2)本发明提供的一种替尔泊肽的制备方法，通过(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对含替尔泊肽的溶液进行第一次纯化，收集纯化后的流出液；(2)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以碳酸氢铵水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对第一次纯化后的流出液进行第二次纯化，得到了纯度更高的替尔泊肽。
技术特征：
1.一种替尔泊肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，s1步骤中，所述偶联之前还包括采用脱保护剂对第一树脂进行脱保护；优选的，所述脱保护剂选自哌啶溶液、吗啉溶液、二乙胺溶液、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯溶液、四氢吡咯溶液、哌嗪溶液中的至少一种；优选的，所述第一树脂与脱保护剂的质量体积比为1g:5-15ml；更优选的，所述哌啶溶液中的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；更优选的，所述哌啶溶液中哌啶的体积百分浓度为15-35％。
3.根据权利要求1所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，s1、s2或s3步骤中，采用含氨基酸衍生物与树脂在缩合剂的存在下进行偶联；优选的，所述缩合剂选自n,n’-二异丙基碳二亚胺、n,n-二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、三乙胺中的至少一种；优选的，所述氨基酸衍生物和缩合剂的摩尔比为1:1-3；优选的，所述氨基酸衍生物与树脂的摩尔比为1-5:1；优选的，所述偶联的温度为0-35℃，时间为0.5-16h。
4.根据权利要求3所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述偶联的反应体系中还包括催化剂；优选的，所述催化剂为1-羟基苯并三唑；优选的，所述缩合剂与催化剂的摩尔比为1-2:1-2。
5.根据权利要求1-4中任一所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，s2步骤或者s4步骤中，采用裂解液裂解肽树脂和/或保护基；优选的，所述第二树脂或替尔泊肽肽树脂与裂解液的质量体积比为1g:5-25ml；优选的，所述裂解的温度为20-28℃；优选的，所述裂解的时间为2-5h；优选的，所述裂解液为由三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇中的至少一种与溶剂的混合液；更优选的，所述混合液中溶剂选自二氯甲烷或水。
6.根据权利要求1-5中任一所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述氨基保护基为c1-c16的烷氧羰基类保护基；优选的，所述c1-c16的烷氧羰基类保护基选自叔丁氧羰基或9-芴甲氧羰基。
7.根据权利要求1-6中任一所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述氨基酸的侧链保护基选自c1-c16的烷氧羰基类保护基、c4-c21的烷基类保护基、c4-c8的烷氧基类保护基中的至少一种；优选的，所述c1-c16的烷氧羰基类保护基为叔丁氧羰基；优选的，所述c4-c21的烷基类保护基选自叔丁基、三苯甲基中的至少一种；优选的，所述c4-c8的烷氧基类保护基为叔丁氧基。
8.根据权利要求1-7中任一所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述第一树脂为(氨甲基)聚苯乙烯树脂；和/或，所述第二树脂为2-氯三苯甲基氯聚苯乙烯树脂；和/或，所述偶联前还包括采用洗涤剂对第一树脂进行洗涤和/或溶胀的步骤；和/或，s2步骤或者s3步骤中，所述偶联结束后还包括采用收缩剂对偶联后的产物进行收缩。
9.根据权利要求1-8中任一所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述替尔泊肽的制备方法中还包括对替尔泊肽进行纯化和干燥的步骤；优选的，所述纯化的步骤包括，(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对含替尔泊肽的溶液进行第一次纯化，收集纯化后的流出液；(2)以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以碳酸氢铵水溶液为洗脱液，采用反相色谱法对第一次纯化后的流出液进行第二次纯化。
10.根据权利要求9所述的替尔泊肽的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液的体积百分浓度为0.05-0.20％；和/或，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为5-50mmol/l；和/或，所述含替尔泊肽的溶液中的溶剂为体积百分浓度为30-40％的三氟乙酸水溶液；和/或，所述第二次纯化后还包括调节流出液的ph为7.8-8.2。
技术总结
本发明涉及药品技术领域，具体涉及一种替尔泊肽的制备方法。包括，分别制备偶联氨基酸衍生物15‑39AA的肽树脂、R1‑(3‑14AA)‑OH片段或者R1‑(5‑14AA)‑OH片段；然后在偶联氨基酸衍生物15‑39AA的肽树脂上采用固相合成的方法依次偶联R1‑(3‑14AA)‑OH、R1‑Tyr(R2)‑Aib‑OH，或者，在偶联氨基酸衍生物15‑39AA的肽树脂上采用固相合成的方法依次偶联R1‑(5‑14AA)‑OH、R1‑Gly‑OH、R1‑Glu(R2)‑OH、R1‑Tyr(R2)‑Aib‑OH，最后裂解肽树脂和保护基得到替尔泊肽。采用本发明的制备方法，提高了替尔泊肽的收率。
技术研发人员：陈玉琛,戴建,李乐
受保护的技术使用者：苏州默迪夫生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23