一种用于皮革文物种属鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法
本发明属于皮革文物分子考古学领域，具体涉及一种用于皮革文物种属鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法。
背景技术：
1、皮革作为古代社会生产生活的重要原料，是文物的重要组成部分。通过对出土的皮质文物进行鉴定分析，可以获得更多考古信息，这对于后续的保护工作具有重要的参考价值。传统的皮革主要原料来自牛、羊等动物，通过植鞣法处理后得到皮革制品。皮革文物在地下长期埋藏或在地上持续暴露在日晒中，易受光照、热度、湿度和微生物等环境因素的影响而降解，表皮形态难以完整保存，内部结构也可能遭到破坏，在更严重的情况下，可能只剩下微量的皮革痕迹残留在土壤中，肉眼难以辨认，最终腐烂消失。
2、皮革文物的严重劣化给鉴定其物种来源带来了极大的困难。一些常用的现代分析设备和检测分析方法，如表面分析、红外光谱分析等，能够对皮革文物的物种进行初步鉴定。但由于文物的稀有性和珍贵性，以及劣化的严重性，检测时最好避免对文物造成二次破坏。此外，由于皮革文物处于复杂的环境中，容易与环境中的其他成分混合，这些因素都可能导致鉴定的准确度不高，无法精确确定皮革的来源物种。因此，面对这些挑战，需要采用新的方法对皮革文物的来源进行鉴定。
3、随着分子生物学的发展，我们可以依托于具有高度种属特异性的dna信息，通过对样品进行dna提取、pcr扩増、测序等一系列过程进行种类鉴定。皮革的鞣制过程以及环境中的酸碱条件可能会对皮革的dna造成破坏，导致经过鞣制的劣化皮革往往难以提取出完整的dna，从而无法进行鉴定。然而，线粒体dna(mtdna)中的细胞色素b(cytb)基因片段相对于核dna留存下来的可能性更大，并且可以通过聚合酶链反应(pcr)进行检测。目前，使用通用引物同时鉴定多个物种的皮革的方法尚未见报道，这表明该领域有待进一步的研究和探索。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现有技术中的不足，并提供一种用于皮革文物种属鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法。
2、本发明所采用的具体技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供一种用于皮革文物种属鉴定的引物，包括如seq id no.1所示的上游引物cytbf和如seq id no.2所示的下游引物cytbr。
4、第二方面，本发明提供一种利用第一方面所述用于皮革文物种属鉴定的引物进行皮革文物种属的鉴定方法，具体步骤如下：
5、s1：提取待检测皮革样品的dna，得到总dna模板；
6、s2：采用如seq id no.1所示的上游引物cytbf和如seq id no.2所示的下游引物cytbr，对步骤s2得到的总dna模板进行pcr扩增反应，得到扩增产物；
7、s3：对步骤s2得到的扩增产物进行双向测序或二代测序，将测序后得到的待检测皮革的序列信息分别与绵羊cytb基因条形码序列、山羊cytb基因条形码序列、黄牛cytb基因条形码序列以及水牛cytb基因条形码序列进行blast相似性对比，判定待检测皮革样品的物种情况。
8、作为优选，步骤s2中所述pcr扩增反应的体系包括：上游引物cytbf 0.4μmol/l，下游引物cytbr 0.4μmol/l，总dna模板20～100ng/ul，taq dna聚合酶0.2u/ul，脱氧核糖核苷三磷酸dntp0.4 mmol/l，mgcl2 1mmol/l以及2×taq缓冲液。
9、进一步的，步骤s2中所述pcr扩增反应的体系为：2×taq pcr mix 12.5μl，10μmol/l上游引物cytbf 1μl，10μmol/l下游引物cytbr 1μl，总dna模板2.0μl，加水至25μl；其中2×taq pcr mix中包含：taq dna聚合酶0.2u/ul，脱氧核糖核苷三磷酸dntp 0.4mmol/l，mgcl2 1mmol/l以及2×taq缓冲液。
10、作为优选，步骤s2中所述pcr扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，循环30次；72℃终延伸5min。
11、作为优选，若待检测皮革样品为混合皮革样品，则步骤s3中对扩增产物进行二代测序；混合皮革样品是指存在多个皮革混合在一起无法分离的或无法判断取得的样品中存在多少个物种组成的情况。
12、作为优选，若待检测皮革样品为单一皮革样品，则步骤s3中对扩增产物进行双向测序。
13、作为优选，步骤s3中采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与绵羊cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为绵羊皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与山羊cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为山羊皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与黄牛cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为黄牛皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与水牛cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为水牛皮革。
14、第三方面，本发明提供一种用于皮革文物种属鉴定的试剂盒，所述试剂盒中各组分构成一个25μl的pcr扩增反应的体系：包括如权利要求1所述的上游引物cytbf 0.4μmol/l、下游引物cytbr 0.4μmol/l、taq dna聚合酶0.2u/ul，脱氧核糖核苷三磷酸dntp0.4mmol/l，mgcl2 1mmol/l以及2×taq缓冲液。
15、第四方面，本发明提供一种利用第二方面所述鉴定方法在皮革文物种属鉴定中的应用。
16、本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
17、本发明首次提出一种基于动物线粒体细胞色素b(cytb)基因片段设计的通用引物。使用这种通用引物，能够扩增得到长度为119bp的dna条形码序列，就能够成功鉴定因老化而外观破坏、难以辨认的绵羊、山羊、黄牛、水牛皮革文物。这种引物不仅适用于单一物种的皮革样品，也适用于混合的皮革样品。
18、本发明提供的引物还能对遭受环境中酸碱破坏的绵羊、山羊、黄牛、水牛皮革文物进行鉴定。它不仅能成功鉴定因老化外观破坏难以辨认的皮革文物，还能将牛、羊这两大类常见皮革来源物种精确细分到种水平，即黄牛与水牛，绵羊与山羊。
19、本发明提供的鉴别方法可以快速、简便、准确地鉴定皮革文物的种属来源，为考古工作中只残留痕迹的混合皮革文物的样品提供一种新的鉴别方式，在文物鉴别、保护与修复领域，具有很重要的意义。
技术特征：
1.一种用于皮革文物种属鉴定的引物，其特征在于，包括如seq id no.1所示的上游引物cytbf和如seq id no.2所示的下游引物cytbr。
2.一种利用权利要求1所述用于皮革文物种属鉴定的引物进行皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增反应的体系包括：上游引物cytbf 0.4μmol/l，下游引物cytbr 0.4μmol/l，总dna模板20～100ng/ul，taq dna聚合酶0.2u/ul，脱氧核糖核苷三磷酸dntp0.4 mmol/l，mgcl2 1mmol/l以及2×taq缓冲液。
4.根据权利要求3所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增反应的体系为：2×taq pcr mix 12.5μl，10μmol/l上游引物cytbf 1μl，10μmol/l下游引物cytbr 1μl，总dna模板2.0μl，加水至25μl；
5.根据权利要求2所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述pcr扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，循环30次；72℃终延伸5min。
6.根据权利要求2所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，若待检测皮革样品为混合皮革样品，则步骤s3中对扩增产物进行二代测序。
7.根据权利要求2所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，若待检测皮革样品为单一皮革样品，则步骤s3中对扩增产物进行双向测序。
8.根据权利要求2所述的皮革文物种属的鉴定方法，其特征在于，步骤s3中采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与绵羊cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为绵羊皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与山羊cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为山羊皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与黄牛cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为黄牛皮革；若采用双向测序得到的待检测皮革的序列信息与水牛cytb基因条形码序列的同源性＞96％，则判定该皮革样品为水牛皮革。
9.一种用于皮革文物种属鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分构成一个25μl的pcr扩增反应的体系：
10.一种利用权利要求2～8任一所述鉴定方法在皮革文物种属鉴定中的应用。
技术总结
本发明公开了一种用于皮革文物种属鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法，属于皮革文物分子考古学领域。本发明提供一种如SEQ ID NO.1所示的上游引物cytbF和如SEQ ID NO.2所示的下游引物cytbR。具体方法如下：(1)提取待检测皮革样品的DNA，得到总DNA模板；(2)采用上游引物cytbF和下游引物cytbR，对总DNA模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；(3)对扩增产物进行双向测序或二代测序，将测序后的结果进行BLAST相似性对比，判定待检测皮革样品的物种情况。该引物不仅能用于单一皮革样品DNA的扩增，也能用于混合皮革样品，此外，还能对遭受环境中酸碱破坏的皮革样品进行鉴定。本发明提供的鉴别方法快速、简便、准确，在文物鉴别、保护与修复领域，具有很重要的意义。
技术研发人员：胡瑜兰,吴倩,张秉坚
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23