用于检测CYP2C19基因突变位点的引物组及方法与流程
本发明属于生物，具体涉及一种用于检测cyp2c19基因突变位点的引物组及方法。
背景技术：
1、细胞色素p450家族2亚家族c多肽19(cyp2c19)基因是细胞色素酶第二亚家族中的重要成员，位于染色体10q23上的细胞色素p450基因簇内，在肝脏中有很高的表达，参与并调节多种临床药物的代谢过程。如抗抑郁药、镇静安眠药苯二氮卓类、抗癫痫药美苯妥英、治疗胃部疾病的质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,ppi)和心脑血管疾病常用的抗血小板凝集药氯吡格雷等。
2、药物代谢酶cyp2c19基因的遗传突变及其在肝脏内表达的变化对不同个体药物代谢能力有显著影响。其中，cyp2c19*2和cyp2c19*3功能丧失性等位基因突变是造成人体药物代谢能力降低的主要突变位点，也是临床中常用的用于指导用药时选择的基因检测位点。具体突变表现为：cyp2c19*2的681g碱基突变成a碱基，导致转录蛋白的剪切突变使代谢酶失活；cyp2c19*3的636g碱基突变成a碱基，形成终止子，破坏转录蛋白的活性。根据相关数据统计，cyp2c19*2和cyp2c19*3两个突变位点能解释几乎100％的东亚人和85％的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷。
3、研究表明，根据cyp2c19基因突变位点数量不同，不同个体对药物的代谢能力可分为：(1)正常代谢者，即没有发生突变，全部为野生基因位点的个体，表现为药物代谢能力正常；(2)中等代谢者，即在人体2条基因链中，一条dna链为正常的野生基因序列，只有一条出现1个cyp2c19*2或cyp2c19*3突变等位基因的个体，表现为药物代谢能力中等程度降低；(3)代谢不良者，即在2条基因链中，共出现2个cyp2c19*2和/或cyp2c19*3突变等位基因的个体，如2条基因链均出现cyp2c19*2突变等位基因或cyp2c19*3突变等位基因，或一条基因链出现cyp2c19*2突变等位基因，另一条基因链出现cyp2c19*3突变等位基因等情况，表现为药物代谢能力大幅度减弱。个体代谢能力的不同在用药选择上也有很大不同。目前常用的处方药物中，12％是由cyp2c19酶代谢的。临床上常用的经由cyp2c19酶代谢的药物包括：心脑血管疾病和支架术后患者常用的血小板凝集抑制剂类药物，抗肿瘤药环磷酰胺，抗hiv病毒药那非那韦，抗疟疾药氯胍等，个体cyp2c19酶代谢能力差异对这些药物的用量均有影响，需要考虑个体cyp2c19强代谢、中等代谢、弱代谢能力对药物剂量的不同需求。
4、目前，cyp2c19基因检测的主要应用技术为聚合酶链反应(polymerase chainreaction，pcr)结合荧光技术和基于pcr基因扩增的基因测序技术，其中pcr荧光检测法为主流检测方法，基因测序法因其价格更加昂贵临床很少选择。随着临床对快速便捷的检测技术的需求，目前已有将核酸提取、pcr反应与结果判读集成为一体机的技术出现，这些技术都是通过简化了核酸提取步骤，加快了pcr反应速度，结合小型化荧光检测仪，实现了poct产品的开发。
5、然而，这这些基于pcr扩增的poct技术依然采用pcr反应扩增结合荧光结果判读的技术原理，所以即便是在步骤自动化，仪器设备小型化的改进下，依旧具有专业性要求较高，仪器设备仍然较大，且对环境要求较高，检测价格较昂贵的局限性。距离真正做到随到随检，方便快捷全自动检测，多场景应用具有较大的差距。同时，pcr反应结合荧光检测的方法，也决定了这一技术路线无法实现多基因同时检测。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种用于检测cyp2c19基因突变位点的引物组。
2、本发明的再一目的是提供上述引物组的应用。
3、本发明的再一目的是提供用于检测cyp2c19基因突变位点的方法。
4、根据本发明具体实施方式的用于检测cyp2c19基因突变位点的引物组，该引物组包括cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物和cyp2c19*3野生型引物；
5、针对cyp2c19基因突变位点的cyp2c19*2和cyp2c19*3基因检测位点，分别设计了用于lamp反应的cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物和cyp2c19*3野生型引物，各用于lamp反应的引物中各有4条特异性引物，包括正向和后外引物(f3和b3)，正向和后内引物(fip和bip)，对靶基因上6个区域进行识别，保证了lamp反应的高度扩增性和特异性，另外，各lamp反应中还设计有1条环引物(lb或lf)，可以减少核酸扩增反应时间，
6、其中，所述cyp2c19*2突变型引物的核苷酸序列如下：
7、
8、所述cyp2c19*2野生型引物的核苷酸序列如下：
9、
10、
11、所述cyp2c19*3突变型引物的核苷酸序列如下：
12、
13、所述cyp2c19*3野生型引物的核苷酸序列如下：
14、
15、又一方面，本发明提供用于检测cyp2c19基因突变位点的引物组的应用，具体的，在检测cyp2c19基因突变位点的试剂盒中的应用，或者，在检测cyp2c19基因突变位点的方法中的应用，在检测cyp2c19基因突变位点的微流控芯片中的应用，尤其是利用环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能技术平台检测cyp2c19基因突变位点。
16、又一方面，本发明还提供了一种用于检测cyp2c19基因突变位点的方法，包括：利用lamp检测技术结合上述的引物组中的cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物和cyp2c19*3野生型引物分别对待测样本进行环介导等温扩增；分析扩增产物的结果。
17、进一步的，所述环介导等温扩增的反应温度为65℃，反应时间为25～30分钟。
18、进一步的，所述环介导等温扩增的程序在包含至少四个反应腔的微流控芯片中进行。
19、具体的，先将2×lamp预混液分别和cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物、cyp2c19*3野生型引物混合，并将各混合液分别注入微流控芯片的四个不同反应腔内，将待测样本用灭菌无酶水稀释后分别注入四个反应腔中形成lamp反应体系，在65℃条件下进行lamp扩增，25～30分钟后扩增结束。
20、本发明的用于检测cyp2c19基因突变位点的方法可以利用环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能技术平台实现。可以通过光谱传感器对各lamp反应的扩增产物进行光谱分析，通过人工智能平台综合cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物、cyp2c19*3野生型引物对待测样本的光谱分析结果，降低假阳性的测试概率，最终快速准确判断个体药物代谢酶的代谢能力差异。
21、本发明的有益效果是，本发明针对药物代谢酶cyp2c19基因的cyp2c19*2和cyp2c19*3基因检测位点基因型的检测结果相互印证，可以快速精准地确定个体对药物的代谢能力差异，为处方药的药物选择、药物剂量把控提供科学指导。，有利于基因检测产品的小型化、集成化、低成本设计和快速检测，操作要求简易，便于临床医学应用。
22、本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
技术特征：
1.一种用于检测cyp2c19基因突变位点的引物组，其特征在于，所述引物组包括cyp2c19*2突变型引物、cyp2c19*2野生型引物、cyp2c19*3突变型引物和cyp2c19*3野生型引物；其中，
2.根据权利要求1所述的引物组在制备检测cyp2c19基因突变位点的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述的引物组在检测个体cyp2c19基因突变位点的方法中的应用。
4.根据权利要求1所述的引物组在检测cyp2c19基因突变位点的微流控芯片中的应用。
5.一种用于检测cyp2c19基因突变位点的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的用于检测cyp2c19基因突变位点的方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的用于检测cyp2c19基因突变位点的方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的用于检测cyp2c19基因突变位点的方法，其特征在于，
技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测CYP2C19基因突变位点的引物组及方法。本发明的用于检测CYP2C19基因突变位点的引物组包含引物的核苷酸序列如：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18；本发明针对药物代谢酶CYP2C19基因的CYP2C19*2和CYP2C19*3位点基因型的检测结果印证，可以快速精准地确定个体对药物代谢能力差异，为处方药的药物选择、药物剂量把控提供科学指导，有利于基因检测产品的小型化、集成化、低成本设计和快速检测，操作简单，便于临床应用。
技术研发人员：陈巧玲,关国良,贾瑶瑶
受保护的技术使用者：常州先趋医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23