一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法
本发明涉及一种小叶兜兰培育方法，具体涉及一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法。
背景技术：
1、兜兰(paphiopedilum spp.)是兰科(orchidaceae)植物中最具特色的一个类群，以其独特魅力和优异性状而备受世界花卉爱好者的钟爱。目前，我国分布的兜兰属植物在《中国生物多样性红色名录》中由高到低列为极危(cr)、濒危(en)、易危(vu)、近危(nt)等级。其中，小叶兜兰(paphiopedilum barbigerum)种群分布量极其稀少，属于濒危(en)等级物种，小叶兜兰列被为一级保护植物。因此，当前关于小叶兜兰的保育研究急需重视关注及采取针对性的保护行动。
2、种苗扩繁和野外种群回归为拯救濒危植物最直接、最有效的方法，可达到恢复和重建种群的目的，对物种种群恢复以及生物多样性保护具有重大现实意义。大量研究表明，特异性菌根真菌在兰科植物种子萌发、幼苗发育以及植株繁殖方面具有不可或缺的作用，兰科植物的稀有性和濒危现状与其共生菌根真菌有着密切关系，如swarts等人发现巨蜘蛛兰(caladenia huegelii)的濒危因素主要受特异性菌根真菌限制。挖掘特异性菌根真菌与并将其应用于兰科植物保育工作已成为兰科植物保育者的基本共识。
3、得力于得天独厚的资源条件，本发明的课题组开展了原生境下小叶兜兰根系菌根真菌多样性研究，并从一典型附生生境中分离了一株特异性菌根真菌epulorhizasp.fqxy019，保藏号为：cctcc no：m 20211513。通过共生培养试验，此菌株显著提高了小叶兜兰种子萌发率，显著增加了小叶兜兰无菌苗的鲜重、叶长、根长及根数量。进一步试验得出，人工气候箱内小叶兜兰种子直播于epulorhiza sp.fqxy019菌丝体上，种子能成功萌发并形成幼苗。换言之，小叶兜兰能与epulorhiza sp.fqxy019菌丝体建立良好的共生体系，成功验证了菌株的潜在特异性(实验室可控条件下促进兰科植物种子萌发的菌根真菌，称之为潜在特异性菌根真菌)。本发明的发明人在已授权的中国专利cn202111468450.x中公开了前述的小叶兜兰菌根真菌epulorhiza sp.fqxy019，并且公开了小叶兜兰菌根真菌与小叶兜兰种子共生培养方法，此方法必须在无菌超净工作台内进行，且种子荚必须实时取样，不能开裂。同时，种子荚表面必须进行消毒灭菌处理，操作更为繁琐，且培养周期较种子直播方法更长。
4、目前，国内外关于兜兰属植物原位共生萌发的研究鲜有报道，且野外原位共生萌发的成功案例极为少见。兜兰属作为兰科植物人工繁殖过程中繁育难度最大的属之一，非常有必要依托特异性菌根真菌开展兜兰种子原位共生萌发技术研发工作，这不仅是兜兰的原生态繁育方式，并且对于珍稀濒危兜兰属植物种群恢复及重建具有非凡意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法，能够将小叶兜兰种子与菌丝体共生培养在土壤基质中，方法简单，极易操作，节约了培育成本，缩短了育苗周期，且种苗长势优良。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法，该方法包含：
3、1、真菌菌丝块的制作
4、将活化培养的保藏编号为cctcc no：m 20211513的菌株epulorhiza sp.fqxy019接种至pda平板培养基上，培养至菌丝体长满培养皿后，获得pda-菌根真菌培养基；
5、用解剖刀将菌丝体沿培养基底部切取下来，菌丝体附带1～2mm的pda培养基，获得菌根真菌-pda菌丝体块；
6、2、培养基质的制备
7、将一层以上的无菌滤纸垫入培养皿内部，倒入无菌自来水，直至滤纸完全浸透为止，将无菌的蛭石或泥炭土均匀铺于所述无菌滤纸上，将所述菌根真菌-pda菌丝体块置于所述蛭石或泥炭土的表面，获得培养基质；
8、3、小叶兜兰种子直播
9、将健壮成熟的小叶兜兰种子荚切开后，将种子均匀撒播于所述培养基质的菌根真菌-pda菌丝体块表面，控制所述菌根真菌-pda菌丝体块上种子密度为30个/cm2，然后用无菌水喷浇至所述培养基质饱和，种子湿润为止；合盖上培养皿，放入温度为24℃，湿度为80％，光照强度为1200lux的人工气候箱，光暗比为18：6；
10、4、小叶兜兰种子共生培育
11、每隔若干天喷洒一次无菌水，共生培养，种子在蛭石上成功萌发形成原球茎，继续共生培养，原球茎分化，长出第一片叶，形成幼苗，再继续共生培养，纤毛状假根出现，幼根长出根毛，形成菌根化种苗；
12、5、菌根化种苗栽培管理
13、选择主根数2条以上且叶片数2～3片的菌根化种苗，将所述菌根化种苗取出，浅种于栽培基质中，露出根茎以上叶片，浇透定根水；其中，所述栽培基质采用质量比为60：20：20的蛭石、植金石和泥炭土配制的混合基质，该混合基质经过消毒处理；
14、对移栽的菌根化种苗进行大棚栽培管理，栽培场地空气流通，遮光度控制在70～80％，生长温度为15～32℃，空气湿度为75～80％，浇水保持栽培基质含水量为35～50％，施加奥绿缓释肥。
15、优选地，所述培养基质的制备，选用的蛭石或泥炭土的粒径为1～2mm。
16、优选地，所述培养基质的制备，将蛭石或泥炭土经121℃下高压灭菌2h后，用0.3％高锰酸钾浸泡消毒30min，用水下将高锰酸钾冲洗干净，获得无菌的蛭石或泥炭土。
17、优选地，所述培养基质的制备，将无菌的蛭石或泥炭土均匀铺于所述无菌滤纸上，厚度为1cm。
18、优选地，所述小叶兜兰种子共生培育，开始每隔2d喷洒一次无菌水，共生培养；共生培养60d后，每间隔5～7d喷洒一次无菌水，纤毛状假根出现。
19、优选地，所述栽培基质，选用的蛭石的粒径为1～2mm，植金石的粒径为3～6mm。
20、优选地，所述栽培基质，基质先用121℃下高压灭菌2～3h，再用0.3％的高锰酸钾溶液喷洒，淋透后，分装于经0.3％高锰酸钾溶液浸泡消毒处理60min后的育苗盘中。
21、优选地，所述大棚栽培管理，生长最适温度为15℃～28℃。
22、优选地，所述大棚栽培管理，夏季早上3～4d浇透水1次；春、秋季4～5d浇透水1次；冬季实时浇水，保持栽培基质含水量为35～50％。
23、优选地，所述奥绿缓释肥的n-p-k为14-13-13。
24、本发明的小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法，具有以下优点：
25、(1)本发明的直播技术无需种子荚的外植体消毒处理，成熟后的小叶兜兰种子荚不需要在超净工作台内进行无菌操作的外植体消毒处理(如升汞、次氯酸钠等消毒处理)，只需破开种子荚后，直接播种于菌丝体上，整个实验过程都适用于普通实验室及常规室内环境操作，操作简易，节约成本；
26、(2)本方法首次报道了关于小叶兜兰种子直播于土壤基质内且成功萌发成苗的技术方法，本发明采用蛭石、泥炭土等土壤基质接种优良菌根真菌epulorhiza sp.fqxy019后，菌丝体可以快速在土壤基质内生长繁殖，形成土壤菌剂，研发的栽培基质菌剂可适用于小叶兜兰种子直接散播于蛭石、泥炭土、腐殖土等土壤基质内，且种子成功萌发并成苗。
27、(3)本发明的方法省时省力又节约成本，缩短了育苗周期，且种苗长势优良，为兜兰人工繁育提供了一种全新技术途径，该技术可作为兜兰人工繁育的替代方法，为兜兰属植物的原位(野外)共生萌发技术奠定坚实基础。
技术特征：
1.一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法，其特征在于，该方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基质的制备，选用的蛭石或泥炭土的粒径为1～2mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基质的制备，将蛭石或泥炭土经121℃下高压灭菌2h后，用0.3％高锰酸钾浸泡消毒30min，用水下将高锰酸钾冲洗干净，获得无菌的蛭石或泥炭土。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基质的制备，将无菌的蛭石或泥炭土均匀铺于所述无菌滤纸上，厚度为1cm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小叶兜兰种子共生培育，开始每隔2d喷洒一次无菌水，共生培养；共生培养60d后，每间隔5～7d喷洒一次无菌水，纤毛状假根出现。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培基质，选用的蛭石的粒径为1～2mm，植金石的粒径为3～6mm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培基质，基质先用121℃下高压灭菌2～3h，再用0.3％的高锰酸钾溶液喷洒，淋透后，分装于经0.3％高锰酸钾溶液浸泡消毒处理60min后的育苗盘中。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大棚栽培管理，生长最适温度为15℃～28℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大棚栽培管理，夏季早上3～4d浇透水1次；春、秋季4～5d浇透水1次；冬季实时浇水，保持栽培基质含水量为35～50％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奥绿缓释肥的n-p-k为14-13-13。
技术总结
本发明公开了一种小叶兜兰种子直播与菌丝体共生培育的方法，该方法包含：1、真菌菌丝块的制作；2、培养基质的制备；3、小叶兜兰种子直播：将健壮成熟的小叶兜兰种子荚切开后，种子均匀撒播于培养基质的菌根真菌‑PDA菌丝体块表面，然后用无菌水喷浇至菌丝体和种子湿润为止；合盖上培养皿，放入温度为24℃，湿度为80％，光照强度为1200lux的人工气候箱，光暗比为18：6；4、小叶兜兰种子共生培育：形成菌根化种苗；5、菌根化种苗栽培管理。本方法首次报道了关于小叶兜兰种子直播于土壤基质内且成功萌发成苗的技术方法，能够将小叶兜兰种子与菌丝体共生培养在土壤基质中，缩短了育苗周期，且种苗长势优良。
技术研发人员：田凡,何跃军,霍达,谢涛,黄郎,杨焱冰,江荣慧
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23