生产人乳低聚糖的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本申请涉及生物工程，特别是涉及一种生产人乳低聚糖的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、人乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)是一类非结合的复合多糖，由d-葡萄糖(glc)、d-半乳糖(gal)、n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、l-岩藻糖(fuc)和唾液酸(sa)等结构单元通过糖苷键连接而成，在人乳中已确认结构的hmos超过200种。

2、目前，通过基因工程菌进行生物合成是一种快速、高效的生产hmos的方法。研究人员通过在底盘细胞中构建hmos代谢通路来实现hmos的生物合成，并通过一些策略来优化和提升hmos的生物合成。例如，研究人员通过增强基因工程菌中乳糖通透酶和糖转运蛋白的表达，从而提高hmos产量。又例如，研究人员发现使用表达marc蛋白的重组细胞对于hmos的发酵产率和纯化效果均有明显的提升。然而，传统的hmos合成方法仍然存在一些不足，限制了其高效合成。

3、因此，人乳低聚糖的合成方法仍有待改进。

技术实现思路

1、基于此，本申请的一个或多个实施例提供了一种生产人乳低聚糖的基因工程菌及其构建方法与应用。技术方案包括：

2、根据本申请实施例的第一方面，提供了一种生产人乳低聚糖的基因工程菌，所述基因工程菌外源表达：

3、(1)sec信号肽；和

4、(2)糖基转移酶。

5、在其中一个实施例中，所述sec信号肽与所述糖基转移酶的n端连接，两者进行共表达。

6、在其中一个实施例中，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-n-三糖ii、乳糖-n-四糖、乳糖-n-新四糖、乳糖-n-岩藻五糖i、乳糖-n-岩藻五糖ii、乳糖-n-岩藻五糖iii、乳糖-n-岩藻五糖iv、乳糖-n-岩藻五糖v和对-乳糖-n-新六糖中的一种或多种。

7、在其中一个实施例中，所述基因工程菌中包括调控元件，所述调控元件包括启动子、增强子和终止子中的一种或多种；

8、可选地，所述启动子包括t7启动子。

9、在其中一个实施例中，所述基因工程菌的基因组中包括lacy基因、prs基因、glmu基因、glmm基因、glms基因、pgm基因、galu基因、gale基因和gtb基因中的一种或者多种基因增强表达。

10、在其中一个实施例中，所述基因工程菌的基因组中包括wcaj基因、lacz基因、fucik基因、nanaket基因、nudd基因、laca基因、nagb基因、gcd基因、ugd基因、wecb基因和seta基因中的一种或者多种基因失活或缺失。

11、根据本申请实施例的第二方面，提供了一种上述的生产人乳低聚糖的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

12、将编码所述sec信号肽和所述糖基转移酶的核酸片段导入底盘细胞，构建所述基因工程菌。

13、在其中一个实施例中，导入的方法包括热激法、电穿孔法、钙离子法和原生质球法中的一种或多种。

14、根据本申请实施例的第三方面，提供了一种人乳低聚糖的制备方法，包括如下步骤：

15、对上述的基因工程菌进行发酵培养，制备人乳低聚糖。

16、根据本申请实施例的第四方面，提供了一种乳制品的生产方法，包括如下步骤：

17、采用上述的制备方法制备人乳低聚糖；和

18、使用所述人乳低聚糖制备乳制品。

19、与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

20、本申请的申请人通过大量研究发现，将sec信号肽以及合成人乳低聚糖所需要的糖基转移酶的编码片段同时转入基因工程菌中，二者共转录，信号肽引导糖基转移酶分泌表达至周质空间，增强其可溶性表达，同时使得人乳低聚糖合成途径的中间产物和终产物分区域进行，最终提升人乳低聚糖的发酵产率。

技术特征：

1.一种生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌外源表达：

2.根据权利要求1所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述sec信号肽与所述糖基转移酶的n端连接，两者进行共表达。

3.根据权利要求1～2任一项所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-n-三糖ii、乳糖-n-四糖、乳糖-n-新四糖、乳糖-n-岩藻五糖i、乳糖-n-岩藻五糖ii、乳糖-n-岩藻五糖iii、乳糖-n-岩藻五糖iv、乳糖-n-岩藻五糖v和对-乳糖-n-新六糖中的一种或多种。

4.根据权利要求1～2任一项所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包括调控元件，所述调控元件包括启动子、增强子和终止子中的一种或多种；

5.根据权利要求1～2任一项所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中包括lacy基因、prs基因、glmu基因、glmm基因、glms基因、pgm基因、galu基因、gale基因和gtb基因中的一种或者多种基因增强表达。

6.根据权利要求1～2任一项所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中包括wcaj基因、lacz基因、fucik基因、nanaket基因、nudd基因、laca基因、nagb基因、gcd基因、ugd基因、wecb基因和seta基因中的一种或者多种基因失活或缺失。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的生产人乳低聚糖的基因工程菌的构建方法，其特征在于，导入的方法包括热激法、电穿孔法、钙离子法和原生质球法中的一种或多种。

9.一种人乳低聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.一种乳制品的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本申请提供了一种生产人乳低聚糖的基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌外源表达：(1)Sec信号肽；和(2)糖基转移酶。本申请的申请人通过大量研究发现，将Sec信号肽以及合成人乳低聚糖所需要的糖基转移酶的编码片段同时转入基因工程菌中，二者共转录，信号肽引导糖基转移酶分泌表达至周质空间，增强其可溶性表达，同时使得人乳低聚糖合成途径的中间产物和终产物分区域进行，最终提升人乳低聚糖的发酵产率。

技术研发人员：李翔宇,刘洋,刘玲,李慕梓,陆姝欢
受保护的技术使用者：嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23