检测NK大颗粒淋巴细胞的抗体组合、试剂盒及其应用的制作方法
本发明属于免疫学检测，具体涉及一种检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、nk大颗粒淋巴细胞白血病(nk-lgll)是一种克隆性nk淋巴细胞增生性疾病，患者多为中老年(中位年龄60岁)，其重要诊断指标是外周血nk细胞不明原因的持续增多(通常＞2*109/l)达6个月以上，外周血形态中常见成熟颗粒淋巴比例升高。此病常累计外周血、骨髓、肝脏、脾脏等，并可导致血细胞减少相关症状。在一些老年人中，尤其是粒细胞减少的患者中，进行nk大颗粒淋巴细胞白血病(nk-lgll)筛查，可以较早识别克隆性nk大颗粒淋巴细胞，便于临床更好的对本病进行早期识别及诊疗。
2、nk大颗粒淋巴细胞白血病(nk-lgll)需要与反应性nk增高相区别，反应性nk细胞增高常继发于病毒感染、自身免疫病、恶性肿瘤等，诱因解除后，nk细胞可自行降低。但这两种情况在血常规中均可以表现淋巴细胞绝对值增加，外周血细胞形态中颗粒淋巴细胞占比增高，很难鉴别。在who造血与淋巴组织肿瘤中提到大颗粒淋巴细胞白血病(nk-lgll)通过流式细胞术免疫表型分析显示出独特的特征。表面cd3阴性、cd16是阳性的、弱cd56表达、可能存在cd2,cd7和cd57的表达减少或丧失,以及cd8的异常均匀表达。在nk-lgll中，nk细胞受体的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)家族的表达是异常的；可以看到受限的kir同种型表达或完全缺乏可检测的kir。因此可以通过流式细胞术检测kir的表达情况来进行精准鉴别。
3、目前检测nk细胞的kir指标有cd158a/cd158b/cd158e等指标，结合cd56、cd16等nk表面标记进行检测，但因为市场上没有系统的检测方案，不同检测机构可有不同的抗体组合，或因抗体组合不全面且不系统导致结果误判的情况。
4、因此，市面上需要一种成体系的检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合及检测试剂盒，有标准的检测方案、操作流程及分析思路，来确保结果的准确性及可比性，助力于临床上nk大颗粒淋巴细胞白血病(nk-lgll)的精准诊断。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种能够快速检测且准确nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合。
2、实现上述目的包括如下技术方案。
3、本发明第一方面提供一种检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合，包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体；
4、所述第一组抗体包括cd158a、cd159c(nkg2c)、cd3、cd56、cd159a(nkg2a)、cd158b、cd7、cd5、cd158e和cd45抗体；
5、所述第二组抗体包括：cd94、cd161、cd16、cd56、cd45ko、cd3、cd8、cd45ra、cd57和cd45抗体；
6、所述第三组抗体包括：granzyme b、perforin、cd3、cd56、ki67、cd2和cd45抗体；每种所述抗体均为标记有检测标记物的单克隆抗体。
7、在其中一些实施例中，所述cd158a、cd94和granzyme b抗体标记同一种荧光素；
8、所述cd159c(nkg2c)、cd161和perforin抗体标记同一种荧光素；
9、所述cd3和cd16抗体标记同一种荧光素；
10、所述cd56抗体标记一种荧光素；
11、所述cd159a(nkg2a)、cd45ro和ki67抗体标记同一种荧光素；
12、所述cd158b和cd3抗体标记同一种荧光素；
13、所述cd7和cd8抗体标记同一种荧光素；
14、所述cd5、cd45ra和cd2抗体标记同一种荧光素；
15、所述cd158e和cd57抗体标记同一种荧光素；
16、所述cd45抗体标记一种荧光素；
17、所述荧光素选自：fitc、pe、ecd、pe-cytm5.5、pe-cy7、apc、apc-700、apc-750、pb、ko。
18、在其中一些实施例中，所述cd158a、cd94和granzyme b抗体标记荧光素fitc；所述cd159c(nkg2c)、cd161和perforin抗体标记荧光素pe；所述cd3和cd16抗体标记荧光素ecd；所述cd56抗体标记荧光素pe-cytm5.5；所述cd159a(nkg2a)、cd45ro和ki67抗体标记荧光素pe-cy7；所述cd158b和cd3抗体标记荧光素apc；所述cd7和cd8抗体标记荧光素apc-700；所述cd5、cd45ra和cd2抗体标记荧光素apc-750；所述cd158e和cd57抗体标记荧光素pb；所述cd45抗体标记荧光素ko；
19、其中，cd3抗体标记荧光素ecd的货号为a07748、cd56抗体标记荧光素pe-cytm5.5的货号为b49189、cd7抗体标记荧光素apc700的货号为b36290、cd5抗体标记荧光素apc750的货号为b92413、cd45抗体标记荧光素ko的货号为b36294、cd16抗体标记荧光素ecd的货号为b49216、cd45ro抗体标记荧光素pecy7的货号为b13648、cd3抗体标记荧光素apc的货号为im2467、cd45ra抗体标记荧光素apc750的货号为b49194、granzymeb抗体标记荧光素fitc的货号为b46038、cd2抗体标记荧光素apc750的货号为b01681，厂家beckmancoulter；
20、cd158a抗体标记荧光素fitc的货号为339504、cd159c(nkg2c)抗体标记荧光素pe的货号为375004、cd159a(nkg2c)抗体标记荧光素pecy7的货号为375114、cd158b抗体标记荧光素apc的货号为312612、cd158e抗体标记荧光素pb的货号为312714、cd94抗体标记荧光素fitc的货号为305504、cd161抗体标记荧光素pe的货号为339904、cd57抗体标记荧光素pb的货号为393326，厂家biolegend；
21、ki67抗体标记荧光素apc的货号为561283，厂家bd；
22、perforin抗体标记荧光素pe的货号为1p-765-t100，厂家exbio。
23、本发明第二方面提供一种检测nk大颗粒淋巴细胞的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合。
24、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括用于流式细胞术检测的试剂。
25、在其中一些实施例中，所述流式细胞术的检测中，通过将待测样本的单细胞悬液分为三份，分别加入第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体进行孵育后，进行流式细胞术检测。
26、在其中一些实施例中，所述单细胞悬液与第一组抗体的体积比100μl：35μl～36μl，其中第一组抗体中各抗体的用量为1.5μl～5μl，所述单细胞悬液中的细胞数浓度为1×105个/ml～1×106个/ml；和/或，
27、所述单细胞悬液与第二组抗体的体积比100μl：31μl～33μl，其中第二组抗体中各抗体的用量为1μl～5μl；和/或，
28、所述单细胞悬液与第三组抗体的体积比100μl：30μl～32μl，其中第三组抗体中各抗体的用量为1μl～10μl；
29、所述单细胞悬液中的细胞数浓度为1×105个/ml～1×106个/ml。
30、本发明第三方面提供一种如上所述的抗体组合或如上所述的试剂盒在辅助检测nk大颗粒淋巴细胞中的应用。
31、本发明第四方面提供一种检测nk大颗粒淋巴细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
32、制备样本单细胞悬液；
33、将待测样本单细胞悬液分为三份，分别加入如上所述的第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体进行孵育；
34、对孵育完成后的待测样本细胞进行流式细胞术检测。
35、在其中一些实施例中，对待测样本细胞进行流式细胞术检测后，还包括：
36、对流式细胞术检测后得到的数据进行分析，判断待测样本细胞的抗体表达模式是否落入正常对照人群抗体的表达模式模板中；其中，待测样本细胞的抗体表达模式和正常对照人群抗体的表达模式通过以下步骤建立：
37、将流式细胞术检测结果的数据，通过设门将有核细胞分群，圈出目的细胞群，再分析所述目的细胞群中各荧光抗体对的表达情况；优选地，所述荧光抗体对包括：cd45-ssc，cd3-cd56，cd3-cd7，cd3-cd5，cd56-cd7，cd56-fs，cd56-cd158a，cd56-cd158b，cd56-cd158e，cd56-cd159a，cd56-cd159c；cd3-cd8，cd56-cd16，cd56-cd94，cd56-cd161，cd56-cd45ro，cd56-cd45ra，cd56-cd57；cd3-cd2，cd56-granzyme b，cd56-perforin，cd56-ki67。
38、本发明所提供的技术方案具有以下的优点及效果：
39、本发明中，发明人经过大量的研究及实验，筛选出三组以cd3-cd56+区为主要目的细胞群，涵盖kir系列(cd158a、cd158b、cd158e)、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、cd94、cd161、granzyme b、perforin、cd45ra、cd45ro、ki67等多种识别nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合，采用该抗体组合可快速简便、高准确率、高灵敏度、高特异性地检出nk大颗粒淋巴细胞。
技术特征：
1.一种检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合，其特征在于，包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体；
2.如权利要求1所述的抗体组合，其特征在于，所述cd158a、cd94和granzyme b抗体标记同一种荧光素；
3.如权利要求2所述的抗体组合，其特征在于，所述cd158a、cd94和granzyme b抗体标记荧光素fitc；所述cd159c(nkg2c)、cd161和perforin抗体标记荧光素pe；所述cd3和cd16抗体标记荧光素ecd；所述cd56抗体标记荧光素pe-cytm5.5；所述cd159a(nkg2a)、cd45ro和ki67抗体标记荧光素pe-cy7；所述cd158b和cd3抗体标记荧光素apc；所述cd7和cd8抗体标记荧光素apc-700；所述cd5、cd45ra和cd2抗体标记荧光素apc-750；所述cd158e和cd57抗体标记荧光素pb；所述cd45抗体标记荧光素ko；
4.一种检测nk大颗粒淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的检测nk大颗粒淋巴细胞的抗体组合。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于流式细胞术检测的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述流式细胞术的检测中，通过将待测样本的单细胞悬液分为三份，分别加入第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体进行孵育后，进行流式细胞术检测。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述单细胞悬液与第一组抗体的体积比100μl：35μl～36μl，其中第一组抗体中各抗体的用量为1.5μl～5μl，所述单细胞悬液中的细胞数浓度为1×105个/ml～1×106个/ml；和/或，
8.权利要求1-3任一项所述的抗体组合或权利要求4-7任一项所述的试剂盒在辅助检测nk大颗粒淋巴细胞中的应用。
9.一种检测nk大颗粒淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，对待测样本细胞进行流式细胞术检测后，还包括：
技术总结
本发明公开一种检测NK大颗粒淋巴细胞的抗体组合，包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体；第一组抗体包括CD158a、CD159c(NKG2C)、CD3、CD56、CD159a(NKG2A)、CD158b、CD7、CD5、CD158e和CD45抗体；第二组抗体包括：CD94、CD161、CD16、CD56、CD45KO、CD3、CD8、CD45RA、CD57和CD45抗体；第三组抗体包括：Granzyme B、Perforin、CD3、CD56、Ki67、CD2和CD45抗体；每种抗体均为标记有检测标记物的单克隆抗体。该抗体组合可快速简便、高准确率、高灵敏度、高特异性地检出NK大颗粒淋巴细胞。
技术研发人员：韦杰,董苹,王佳佳,李海艳,李亚如,王青,范昌军,卞孟姣
受保护的技术使用者：济南金域医学检验中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23