一种植株籽粒大小调控基因及其应用
本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及一种pcfs家族基因，及通过突变该基因来获得农艺性状改良植株的方法。
背景技术：
1、人口持续增长与耕地面积不断减少的现状，对全球粮食安全提出了严峻的挑战。如何通过生物技术的手段，挖掘优质基因资源，应用于作物育种，从而获得高产量、高质量、利于机械化耕作的作物品种，是全人类的重要课题。
2、植物籽粒大小是农业生产中重点关注的性状，直接影响农作物的产量，水稻、小麦、玉米等主粮作物的籽粒变大可以提高粮食产量，油菜，大豆等油料作物的籽粒变大可以提高产油量，对于促进农业生产至关重要。此外，农作物在生长的过程中，常常受到恶劣的环境的影响，比如干旱、盐胁迫、病虫灾害等，因此，选取抗旱、抗盐、抗病虫害等抗性强的品种，可以有效提高植物的抗性和适应力，以达到高产的目的。对于油菜具有的分枝多且分枝上的果荚成熟晚，机器常常不能收获到侧枝上籽粒的问题，如何获得合理株型也是作物育种中十分关注的课题。由以上可知，不论是籽粒变大，分枝变少，还是对渗透胁迫的抗性增强，都是农业上的有利性状，对于提高作物产量、发展现代化农业非常重要。
3、pcfs(pcf11-similar protein)同源基因最早报道是在酵母中，酵母中的基因名称为pcf11(protein 1ofcfi)，使用酵母pcf11的蛋白序列进行基因比对，可在植物中找到相关的同源蛋白。在高等植物中，pcfs家族一般有两个或两个以上的同源基因。在此之前，很少有人关注植物中pcfs家族的基因功能。本发明的发明人在探索pcfs家族的基因功能时，通过crispr/cas9技术对拟南芥、油菜、玉米、大豆、水稻等植株的pcfs家族基因进行编辑，拿到突变体后，出乎意料的发现n端完整的pcfs家族基因的突变，可以调控植株的籽粒大小，使植株的籽粒变大变重，同时部分pcfs基因突变还有增强植株对逆境胁迫的耐受性、减少分枝数的功能。本发明所提供的基因、突变体及其应用方法，有助于提高作物产量和改善品质，增强植株对逆境的抗性，为培育具有大粒重、抗逆性强的植物新品种提供了基因资源和技术支持，对作物农艺性状的改良和高产、强抗逆性分子育种工作具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
1、本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明,本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明,本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用,而非加以限制。
2、本发明实施例提供了一种基因及其突变体核苷酸序列，其特征在于，所述基因突变的植株，其籽粒变大，所述基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
3、(a)拟南芥中基因号为at2g36480或at4g04885的核苷酸序列；
4、(b)玉米中基因号为zm00001d000023、zm00001d005350、zm00001d019856或zm00001d049442的核苷酸序列；
5、(c)在严谨条件下能够与(a)-(e)之任一所述核苷酸序列杂交的dna序列；或
6、(d)与(a)-(f)之任一所述核苷酸序列互补的dna序列。
7、本发明实施例提供了一种基因及其突变体核苷酸序列，所述基因突变后具有植株籽粒变大和/或变种的表型，所述基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
8、(a)如seq id no：1、2、4、5、7、8、10或11所示的核苷酸序列；
9、(b)其编码氨基酸序列如seq id no：3、6、9或12的核苷酸序列；
10、(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列杂交的dna序列；
11、(d)与(a)-(c)所述序列有至少95％(优选为至少98％)序列相似性，且突变后具有籽粒变大变重功能的dna序列；或
12、(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的dna序列。
13、本发明实施例中提供的上述基因可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明所述的基因还包括与该基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且突变后具有同样的籽粒变大变重功能的同源基因。所述同源基因包括在严谨条件下能够与本发明实施例所公开的基因的核苷酸序列杂交的dna序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mm nacl、40mm pipes(ph6.4)和1mm edta的杂交液中杂交，所述杂交的温度优选是53℃-60℃，杂交时间优选为12-16小时，然后用含0.5×ssc和0.1％sds的洗涤液洗涤，洗涤温度优选为62℃-68℃，洗涤时间为15-60分钟。
14、同源基因还包括与本发明实施例所公开的基因所示的dna序列有至少95％、98％、或99％序列相似性，且突变后具有同样的籽粒变大变重功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。更具体地，所述pcfs家族基因dna序列编码的蛋白氨基酸序列具有完整的n端，所述n端的氨基酸序列为
15、y...lxeltxnxkpxitxltixa...e...qxlpxlylldsivknxgxxy...f...lxxvfxxay...mxxlfxtwxxv f...lxxi...l...ih(x代表任一氨基酸，...代表超过任意三个随机氨基酸序列，其余字母代表特定氨基酸)。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
16、本领域技术人员应该知晓，同一种植物不同品种间的同一基因存在单核苷酸多样性(single nucleotide polymorphism,snp)，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，但同一作物品种数量很多，发明人不可能进行一一列举，本发明仅提供了不同作物中具有代表性的品种的序列。因此，本领域技术人员应该知悉，不同品种来源的与本发明所保护基因及其核苷酸序列存在snp的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。
17、本发明实施例所述的突变是指在本发明基因的核苷酸序列上进行取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸获得，所述基因突变后具有改善农艺性状的功能，包括使植株籽粒变重和/或变大，其中pcfs4(基因编号为at4g04885)单基因突变或是pcfs2和pcfs4双突之后，还具有增加耐逆性和/或减少分枝数等的调控功能。本发明实施例所述的突变可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变。所述突变可以通过物理诱变、化学诱变或基因编辑的方式获得,化学诱变的方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变；基因编辑的方法包括但不限于zfn、talen和/或crispr/cas9等基因编辑方法。
18、更具体地，在通过crispr/cas9基因编辑方法获得本发明实施例中基因突变体核苷酸序列时，所述crispr/cas9基因编辑方法所用的靶点序列选自下列组的序列之一:
19、(a)序列为seq id no：1、2、4、5、7、8、10或11所示核苷酸序列中符合5’-nx-ngg-3’序列排列规则的片段，其中n表示a、g、c和t中的任一种,14<x<30,且x为整数,nx表示x个连续的核苷酸；或
20、(b)与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
21、更具体地，在使用crispr/cas9技术进行基因编辑时，针对拟南芥植株的靶点序列如seq id no:13-716之任一所示，针对玉米植株的靶点序列如seq id no:17-20之任一所示。
22、根据本发明实施例所述的基因突变体核苷酸序列，其特征在于，所述基因突变体的核苷酸序列如seq id no:21或22之任一所示。
23、本发明实施例还公开了一种调控植株农艺性状的方法，其特征在于通过突变植株的下述基因，使植株籽粒变大变重，所述基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
24、(a)拟南芥中基因号为at2g36480或at4g04885的核苷酸序列；
25、玉米中基因号为zm00001d000023、zm00001d005350、zm00001d019856或zm00001d049442的核苷酸序列；
26、(b)在严谨条件下能够与(a)-(e)之任一所述核苷酸序列杂交的dna序列；或
27、(c)与(a)-(f)之任一所述核苷酸序列互补的dna序列。
28、具体地，本发明实施例所公开的调控植株农艺性状的方法，其特征在于通过突变植株的下述基因，使植株籽粒变大变重，所述基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
29、(a)如seq id no：1、2、4、5、7、8、10或11所示的核苷酸序列；
30、(b)其编码氨基酸序列如seq id no：3、6、9或12所示的核苷酸序列；
31、(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列杂交的dna序列；
32、(d)与(a)-(c)所述序列有至少95％(优选为至少98％)序列相似性，且突变后具有籽粒变大功能的dna序列；或
33、(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的dna序列。
34、本发明实施例中提供的调控植株农艺性状的方法，其中所述的基因可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明所述的调控植株农艺性状的方法中，所使用的基因还包括与该基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且突变后具有同样的籽粒变大变重功能的同源基因。所述同源基因包括在严谨条件下能够与本发明实施例所公开的基因的核苷酸序列杂交的dna序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mmnacl、40mm pipes(ph6.4)和1mm edta的杂交液中杂交，所述杂交的温度优选是53℃-60℃，杂交时间优选为12-16小时，然后用含0.5×ssc和0.1％sds的洗涤液洗涤，洗涤温度优选为62℃-68℃，洗涤时间为15-60分钟。
35、同源基因还包括与本发明实施例所公开的pcfs家族基因所示的dna序列有至少95％、98％、或99％序列相似性，且突变后具有同样的籽粒变大变重功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。更具体地，所述pcfs家族基因dna序列编码的蛋白氨基酸序列具有完整的n端，所述n端的氨基酸序列为
36、y...lxeltxnxkpxitxltixa...e...qxlpxlylldsivknxgxxy...f...lxxvfxxay...mxxlfxtwxxv f...lxxi...l...ih(x代表任一氨基酸，...代表超过任意三个随机氨基酸序列，其余字母代表特定氨基酸)。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
37、本发明实施例所述调控植株农艺性状的方法中，其中所述的突变是指在本发明所披露基因的核苷酸序列上进行取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸获得，所述基因突变后具有改善农艺性状的功能，包括使植株籽粒变重和/或变大，其中pcfs4(基因号为at4g04885)单基因突变或是pcfs2和pcfs4双基因突变之后，还具有增加耐逆性和/或减少分枝数等的调控功能。本发明实施例所述的突变可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变。所述突变可以通过物理诱变、化学诱变或基因编辑的方式获得,化学诱变的方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变；基因编辑的方法包括但不限于zfn、talen和/或crispr/cas9等基因编辑方法。
38、更具体地，在使用crispr/cas9技术进行植株农艺性状调控时，所用的靶点序列选自下列组的任一序列之一:
39、(a)序列为seq id no：1、2、4、5、7、8、10或11所示核苷酸序列中符合5’-nx-ngg-3’序列排列规则的片段，其中n表示a、g、c和t中的任一种,14<x<30,且x为整数,nx表示x个连续的核苷酸；或
40、(b)与(a)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
41、更具体地，在使用crispr/cas9技术进行基因编辑时，针对拟南芥植株的靶点序列如seq id no:13-716之任一所示，针对玉米植株的靶点序列如seq id no:17-20之任一所示。
42、根据本发明实施例所述的基因突变体核苷酸序列，其特征在于，所述基因突变体的核苷酸序列如seq id no:21或22之任一所示。
43、本发明实施例还公开了一种非作为繁殖材料的植物细胞、组织、器官或产品，其特征在于，所述植物细胞、组织、器官或产品含有本发明前述任一所述的基因突变体核苷酸序列。
44、本发明实施例还公开了前述任一所述的方法、及其获得的突变体材料在育种中的应用。具体地，所述在育种中的应用是指通过基因突变的方式，或是通过与本发明基因突变体材料杂交的方式，获得该基因突变体，使植株呈现籽粒变重和/或变大的表型。
45、与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
46、1)本发明提供了一种植株籽粒大小调控基因,所述基因属于pcfs家族基因，所述基因编码的蛋白氨基酸序列的n端具有保守结构域，所述结构域的序列为y...lxeltxnxkpxitxltixa...e...qxlpxlylldsivknxgxxy...f...lxxvfxxay...mxxlfxtwxxvf...lxxi...l...ih(x代表任一氨基酸，...代表超过任意三个随机氨基酸序列，其余字母代表特定氨基酸)。
47、2)本发明所提供的pcfs基因突变后可使植株的籽粒变大,从而增加植株的产量,为作物的高产育种提供了新的基因资源。
48、3)本发明提供的pcfs家族基因可以作为控制作物籽粒大小、提高产量和品质的一个基因,应用于作物品种的改良,有助于选育出优质性状的作物新品种。同时,本发明基因还可用于分子标记技术,为作物大粒高产育种等实际生产应用服务。
49、4)本发明提供的pcfs基因在拟南芥、玉米等众多植物中具有同源基因,不仅可以用于前述植物的育种,还可用于其它植物的新品种培育。
技术特征：
1.一种调控玉米植株农艺性状的方法，其特征在于通过功能缺失性突变植株内源n端完整的pcfs家族基因，使植株籽粒变大和/或千粒重提高，所述基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基因的突变包括在该基因的核苷酸序列上进行取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸。
3.根据权利要求2之任一所述的方法，其特征在于所述突变通过物理诱变、化学诱变、zfn、talen或crispr/cas9等技术获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中所述的crispr/cas9技术所用的靶点序列选自下列组的序列之一:
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述的crispr/cas9技术所用的靶点序列如seq id no:17-20之任一所示的序列。
6.根据权利要求1、3或4之任一所述的方法，其特征在于，所述基因突变后的核苷酸序列如seq id no:21和22之任一所示。
7.权利要求1-6之任一所述的方法在育种中的应用，所述在育种中的应用是指通过基因功能缺失性突变或与突变体材料杂交的方式，使植株获得该基因突变体，呈现籽粒变大和/或千粒重提高的表型。
技术总结
本发明公开了一种植株籽粒大小调控基因及其应用，属于生物技术领域。本发明通过基因编辑的方式，获得不同作物中的PCFS基因突变体，并通过实验及统计分析发现所述突变体具有植株籽粒变大的表型，部分突变体具有耐胁迫能力提高的表型。本发明所提供的基因、突变体及其应用方法，有助于提高作物产量和改善品质，增强植株对逆境的抗性，为培育具有大粒重、抗逆性强的植物新品种提供了基因资源和技术支持，对作物农艺性状的改良和高产、强抗逆性分子育种工作具有重要的意义和应用价值。
技术研发人员：马力耕,曹颖,吴静
受保护的技术使用者：首都师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23