一种在猪凝血因子Ⅶ和Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ和Ⅷ编码基因的方法及应用与流程

本发明涉及基因编辑，尤其涉及一种在猪凝血因子ⅶ和ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ和ⅷ编码基因的方法及应用。

背景技术：

1、凝血因子是血浆与组织中直接参与凝血的一大类物质统称，其中大多是由肝脏合成并分泌至血浆的蛋白质，对于机体出血后的凝血至关重要。在凝血过程中，不同凝血因子按一定次序被先后激活，通过内源性和外源性凝血途径的凝血级联反应(“凝血瀑布”学说)，最终实现凝血功能。

2、凝血因子缺陷导致凝血功能障碍，造成血友病等多种出血性疾病。临床上，通过外源输注缺失的凝血因子的替代疗法是当前治疗血友病的有效手段。其中，凝血因子ⅷ(coagulation factorⅷ，fⅷ)是内源性凝血途径的关键因子，其缺陷导致的血友病a，占人类血友病患者的80％～85％，因而对治疗用fⅷ的需求量较大。此外，对于部分接受外源输注凝血因子治疗的患者，体内产生相应凝血因子抗体，降低了治疗效果并增加了治疗风险。针对这类患者，参与外源凝血途径的关键因子凝血因子ⅶ(fⅶ)是首选替代药物。fⅶ也被广泛用于创伤性出血的治疗，因此临床对fⅶ同样有较大需求量。

3、目前用于治疗的人类凝血因子制品主要来源于人类血浆，原料来源较为受限；早期也直接使用猪血浆凝血因子制品，但猪凝血因子与人类凝血因子并不完全相同；借助于基因工程技术，国外有用来自于体外培养的中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)表达的重组人类fⅶ和fⅷ蛋白以及重组猪fⅷ蛋白产品，但由于蛋白表达水平偏低且蛋白翻译后修饰不完全，影响分泌、蛋白活性及半衰期等，再加上技术壁垒高、生产工艺复杂、产量小、成本较高，当前也缺乏国产化产品。因此，需要开发新的高效制备人类fⅶ和fⅷ的方法。近几十年来，用基因改造的动物或植物作为生物反应器生产人类功能性蛋白的技术，有望为人类凝血因子生产提供新的来源。比如，通过转基因技术，用乳腺特异性表达载体在羊或兔等哺乳动物乳腺表达人类fⅶ或fⅷ蛋白。乳腺生物反应器存在局限性，一方面目的基因在动物基因组中整合存在较大随机性，结果不稳定，目的蛋白表达水平存在较大个体差异；另一方面，蛋白加工和修饰系统在物种间和组织间存在较大差异，影响目的蛋白的活性、免疫原性和药代动力学等凝血因子特性。同时，乳腺生物反应器生产的目的蛋白仅占乳腺分泌的总蛋白的很小比例，增加了目的蛋白的纯化难度。将功能蛋白敲入动物基因组内源性位点，使其原位表达，可以获得翻译后修饰更完整的目的蛋白。羊和牛虽然也可以用于开发血液生物反应器，但人兽共患病的风险更高(如布鲁氏菌病、朊病毒感染、结核病等)。相比而言，猪的生理、代谢和蛋白翻译后修饰系统等方面与人类更相近，便于大规模繁殖饲养，人兽共患病风险低。当前，通过将人类血清白蛋白编码序列定点敲入到猪白蛋白基因位点，将猪作为血液生物反应器生产人类白蛋白，已有报道。利用猪作为血液生物反应器生产人类凝血因子还有待开发。

4、此外，猪作为一种理想的异种器官移植供体，有望解决人类器官移植中的供体器官短缺问题。解决人与猪器官间不相容性是该领域长期关键人物，其中凝血系统的不兼容性是重要方面。过去研究主要集中在免疫排斥反应问题上，凝血方面主要表达血栓调节蛋白。随着研究深入，对猪与人类之间功能蛋白人源化越来越受到重视，而凝血因子人源化是其中重要部分。构建仅表达人类凝血因子而不表达猪凝血因子的人源化猪模型，对于改善异种移植效果具有重要价值，特别是肝脏异种移植(大部分凝血因子是由肝脏合成)。比如，有报道在猪的fⅶ基因(f7)位点同时敲入人类fⅶ和人类白蛋白表达序列，进行人源化修饰(li l,meng h,zou q,et al.establishment of gene-edited pigs expressing humanblood-coagulation factor vii and albumin for bioartificial liver use[j].jgastroenterol hepatol,2019,34(10):1851-1859.)。但由于额外敲入人类白蛋白表达序列，并未完全模拟人类fⅶ人源化修饰，且可能表达猪fⅶ蛋白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供有效对靶位点进行切割的一种在猪凝血因子ⅶ和ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ和ⅷ编码基因的方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgrna，

4、所述一组sgrna包括在猪凝血因子ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ编码基因的第一sgrna、在猪凝血因子ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅷ编码基因的第二sgrna；

5、所述第一sgrna的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述第二sgrna的核苷酸序列如seq id no：5所示。

6、所述猪凝血因子ⅶ基因在ncbi上的登录号为nc_010453，所述猪凝血因子ⅷ基因在ncbi上的登录号为nc_010461。本发明的sgrna有效对猪凝血因子ⅶ基因位点和猪凝血因子ⅷ基因位点进行定点切割。

7、第二方面，本发明还提供了一种表达所述sgrna的表达载体。

8、进一步地，表达所述第一sgrna的表达载体的核苷酸序列如seq id no：18所示，表达所述第二sgrna的表达载体的核苷酸序列如seq id no：19所示。

9、第三方面，一种用crispr/cas9基因编辑技术在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的打靶载体，在猪凝血因子ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子fⅶ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如seq id no：16所示；在猪凝血因子ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅷ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如seq id no：17所示。

10、第四方面，本发明提供了所述sgrna、所述表达载体和所述打靶载体在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞中的应用。

11、第五方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，在猪胎儿成纤维细胞内共转染所述sgrna表达载体和所述打靶载体，进行培养。

12、进一步地，sgrna靶向识别位点在猪凝血因子编码基因的第1内含子内，猪凝血因子ⅶ基因位点的sgrna靶向识别位点的正义链核苷酸序列如seq id no：8所示，反义链核苷酸序列如seq id no：9所示；猪凝血因子ⅷ基因位点的sgrna靶向识别位点的正义链核苷酸序列如seq id no：14所示，反义链核苷酸序列如seq id no：15所示。

13、在本发明具体实施例中，所述制备方法包括以下步骤：

14、s1：取所述sgrna表达载体和所述打靶载体各5～15μg，优选10μg，混合，得到混合质粒；

15、s2：将步骤s1的混合质粒转染至猪胎儿成纤维细胞中，电转，得到电转后的细胞；

16、s3：将步骤s2电转后的细胞培养成单克隆细胞，得到靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞。

17、进一步地，步骤s1中，将核苷酸序列如seq id no：18所示的sgrna表达载体和核苷酸序列如seq id no：16所示的打靶载体各10μg，混合，得到混合质粒1；将核苷酸序列如seqid no：19所示的sgrna表达载体和核苷酸序列如seq id no：17所示的打靶载体各10μg，混合，得到混合质粒2。

18、混合质粒1培养得到的靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞为在猪凝血因子ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅶ编码基因的猪胎儿成纤维细胞；

19、混合质粒2培养得到的靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞为在猪凝血因子ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅷ编码基因的猪胎儿成纤维细胞。

20、进一步地，步骤s2电转的参数为：1350v、30ms和1pulse。

21、进一步地，步骤s3细胞铺于培养皿中的密度为50～5000个/皿。优选步骤s2中混合质粒1的电转后的细胞密度为3000～5000个/皿，步骤s2中混合质粒2的电转后的细胞密度为50～100个/皿。

22、进一步地，步骤s3用含胎牛血清的高糖dmem培养基培养细胞。

23、进一步地，步骤s3胎牛血清的浓度为15％(v/v)。

24、进一步地，步骤s3培养条件为38.5℃、5％ co2培养箱中培养。

25、进一步地，步骤s3培养基中嘌呤霉素的浓度为0.3～1μg/ml，优选1μg/ml。

26、进一步地，步骤s3培养时间为8～12天。

27、进一步地，步骤s3中，对混合质粒1制备得到的电转后的细胞，培养基中添加嘌呤霉素进行筛选。

28、第六方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞，由所述制备方法制备得到。

29、第七方面，本发明提供了所述猪胎儿成纤维细胞在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪中的应用。

30、第八方面，本发明提供了一种靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪的制备方法，将所述猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，融合形成重组胚胎，重组胚胎移植到代孕母猪体内，妊娠产仔后，获得所述基因编辑猪。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

32、本发明针对猪凝血因子ⅶ编码基因f7和猪凝血因子ⅷ编码基因f8的第1内含子特定位点，分别设计sgrna和打靶载体，将人凝血因子fⅶ和fⅷ蛋白编码基因定点敲入，以猪f7基因内源性启动子启动人凝血因子fⅶ蛋白表达，以猪f8基因内源性启动子启动人凝血因子fⅷ蛋白表达，表达水平与生理水平相当，不会对制备的基因编辑猪的健康状况产生显著影响，用于大规模生产人凝血因子fⅶ和fⅷ蛋白产品，同时使猪内源性凝血因子编码基因由于敲入的人凝血因子编码基因而被阻断，不能表达。并且人fⅶ和fⅷ单个蛋白人源化及两个蛋白人源化均可以实现，也可以与其他功能蛋白(如血清白蛋白)人源化的猪进行交配，获得更多功能蛋白同时人源化的猪模型，是更灵活、理想的凝血因子等多种功能蛋白人源化修饰方案，可用于完善异种移植相关基因修饰。

技术特征：

1.一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgrna，其特征在于，

2.一种表达权利要求1所述sgrna的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，表达所述第一sgrna的表达载体的核苷酸序列如seq id no：18所示，表达所述第二sgrna的表达载体的核苷酸序列如seq idno：19所示。

4.一种用crispr/cas9基因编辑技术在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的打靶载体，其特征在于，在猪凝血因子ⅶ基因位点靶向敲入人凝血因子fⅶ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如seq id no：16所示；在猪凝血因子ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子ⅷ编码基因的打靶载体的核苷酸序列如seq id no：17所示。

5.权利要求1所述sgrna、权利要求2或3所述表达载体和权利要求4所述打靶载体在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞中的应用。

6.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，其特征在于，在猪胎儿成纤维细胞内共转染权利要求2或3所述表达载体和权利要求4所述打靶载体，进行培养。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，sgrna靶向识别位点在猪凝血因子编码基因的第1内含子内，猪凝血因子ⅶ基因位点的sgrna靶向识别位点的正义链核苷酸序列如seq id no：8所示，反义链核苷酸序列如seq id no：9所示；猪凝血因子ⅷ基因位点的sgrna靶向识别位点的正义链核苷酸序列如seq id no：14所示，反义链核苷酸序列如seq id no：15所示。

8.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的猪胎儿成纤维细胞，其特征在于，由权利要求6或7所述制备方法制备得到。

9.权利要求8所述猪胎儿成纤维细胞在制备靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪中的应用。

10.一种靶向敲入人凝血因子编码基因的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述猪胎儿成纤维细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，融合形成重组胚胎，重组胚胎移植到代孕母猪体内，妊娠产仔后，获得所述基因编辑猪。

技术总结
本发明涉及一种在猪凝血因子Ⅶ和Ⅷ基因位点靶向敲入人凝血因子Ⅶ和Ⅷ编码基因的方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明提供了一组在猪凝血因子基因位点靶向敲入人凝血因子编码基因的sgRNA。针对猪凝血因子Ⅶ编码基因F7和猪凝血因子Ⅷ编码基因F8的第1内含子特定位点，分别设计sgRNA和打靶载体，将人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白编码基因定点敲入，以猪F7基因内源性启动子启动人凝血因子FⅦ蛋白表达，以猪F8基因内源性启动子启动人凝血因子FⅧ蛋白表达，表达水平与生理水平相当，不会对制备的基因编辑猪的健康状况产生显著影响，用于大规模生产人凝血因子FⅦ和FⅧ蛋白产品。

技术研发人员：陆芳,汪金玲
受保护的技术使用者：广州中科飞豚生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23