一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用

本发明涉及生物防治，具体涉及一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用。

背景技术：

1、莱氏绿僵菌，又名莱氏野村菌，是一种丝状昆虫病原真菌，它能感染很多鳞翅目昆虫，如草地贪夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾。尤其是在近年来爆发的草地贪夜蛾灾害中，很多莱氏绿僵菌菌株被分离纯化从患病的草地贪夜蛾虫尸上在田间。可见，莱氏绿僵菌对于防治草地贪夜蛾具有良好的研究价值和应用前景。不仅如此，莱氏绿僵菌还是一种植物内生菌，它在植物-内生真菌-昆虫之间的相互作用方面起到重要作用。然而，莱氏绿僵菌作为一种二态型真菌，生长较为缓慢，与其他昆虫病原真菌相比。因此，通过遗传转化手段获取开发并改造莱氏绿僵菌是一项急需解决的问题。

2、自mishra和tatum(1973)首次报道粗糙脉孢菌的dna转化以来，许多丝状真菌已实现了dna转化。诸如球孢白僵菌这些昆虫病原真菌的遗传转化相继得到建立，广泛地应用到基因功能解析以及相关的病理学及生理学研究。dna遗传转化是人们进行菌种改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途径。近年来，真菌遗传转化得到迅猛发展，并应用到多个物种的基因的生理、生化、病理功能研究。如粒子轰击，聚乙二醇/cacl2，修正的聚乙烯乙二醇/cacl2方法，聚乙二醇介导法(polyethylene glycol，peg)、电激法、基因枪法原生质体转化法、脂质体转化法、限制性酶介导整合法(restriction enzyme mediatedintegration，remi)。然而，原生质体转化法转化周期短，但阳性率偏低且原生质体制备烦琐。脂质体转化法运载能力强，但会对细胞产生毒性且容易污染。电击转化法转化速度快但转化率较低。限制性酶介导整合法需确定内切酶的种类和浓度，不适于推广使用。

3、农杆菌介导的遗传转化(agrobaeterium tumefaciens-meidatedtransformation)可快速构建真菌t-dna(transferdna)随机插入突变体，因其高效易操作，可转化完整的细胞，比如分生孢子、菌丝、子实体等，免去了制备原生质体的繁琐，广泛应用于多种真菌。该方法是真菌遗传转化、基因克隆的有力工具，也可导致同源重组，从而促进基因敲除。shao等人利用农杆菌转化莱氏绿僵菌芽生孢子，并成功筛选得到突变体。但是由于莱氏绿僵菌生长缓慢影响根瘤农杆菌的转化效率。可见，一种转化效率更高的遗传转化方法对于莱氏绿僵菌而言显得尤为重要，它影响我们对莱氏绿僵菌的基因功能的认识以及进一步挖掘生防真菌毒力基因。

4、多项研究表明，从自然界中分离到的昆虫病原真菌对害虫的致病力有限，导致其在农业生产和应用中效果不太理想。这是制约杀虫真菌制剂推广和使用重要因素之一。莱氏绿僵菌既是一种对鳞翅目昆虫有很强致病性的丝状昆虫病原真菌，也是一种植物内生菌，对植物生长具有良好的促生作用。然而，作为一种二态性真菌，莱氏绿僵菌培养和遗传转化较为难度。

5、本发明构建了一个包含潮霉素抗性基因和gfp报告基因的工程菌株。通过根癌农杆菌的转化成功将莱氏绿僵菌菌株szcy201010中nor_03501基因敲除。通过感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育，将挑选的转化子的成功转化率提高到54％(nor_03501)。同时，本发明对比了分生孢子、芽孢、冻存芽孢、芽生孢子和感受态芽孢的转化率，确定了利用感受态芽孢的遗传转化率是最高的。最后，还利用pcr、激光共聚焦荧光快速筛查、rt-qpcr技术对真菌的转化子进行验证，验证了本技术的可靠性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用，为研究莱氏绿僵菌重组表达和基因功能提供了一个快速便捷的基因操作工具，为莱氏绿僵菌功能基因的发掘和高毒力菌株的改造提供了技术保障。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

3、一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：

4、s1：构建二元载体：将目的基因nor_03501与适配莱氏绿僵菌的载体连接，构建稳定的二元载体；

5、s2：根瘤农杆菌转化：利用根瘤农杆菌介导基因传递的方法，将二元载体导入莱氏绿僵菌感受态孢子中；

6、s3：感受态芽孢制备：分别用分生孢子、酵母态芽孢、冻存的酵母态芽孢、芽孢、感受态芽孢5种孢子在培养基中培养转化后的感受态孢子，促使其形成真菌的营养菌丝；

7、s4：真菌遗传转化及比较：将感受态孢子接种在培养基上，实现外源基因在莱氏绿僵菌基因组中的稳定转化；比较不同无性孢子形态对转化效率的影响，筛选出高效的无性孢子。

8、进一步的，所述步骤s1具体包括：由p-gtb(ptef：gfp-ptrpc：bar)载体改造而来的pgth(ptef：gfp-ptrpc：hygb)被用于敲除工程菌株构建，大肠杆菌菌株dh-5α用于构建和二元载体的扩增；

9、nor_03501基因的上游片段(1.2kb)和下游片段(1.6kb)均由莱氏绿僵菌中的基因组中pcr扩增获得；pcr扩增产物末端分别添加了15-20bp与pgth载体同源的序列，为了更加快速高效地连接转化。扩增引物包括：nor_03501-p1、nor_03501-p2、nor_03501-p3、nor_03501-p4、nor_03501-p5、nor_03501-p6；其核苷酸序列如seq id no.1-6所示。

10、pgth原始载体均使用xmai和bamhi限制性内切酶双酶切。酶切产物使用pcr产物纯化试剂盒纯化。将回收得到的载体骨架片段与目的基因的上游片段连接。转化至感受态大肠杆菌，筛选连接正确的阳性单菌落。一元载体pgth使用xbai和hpai限制性内切酶双酶切，酶切产物电泳分离，切胶回收载体骨架片段。将回收得到的载体骨架片段与酶切后的下游目的基因表达盒和下游目的基因表达盒连接。转化至感受态大肠杆菌。筛选连接正确的阳性单菌落。得到的目的基因的二元敲除载体。

11、进一步的，所述步骤s2具体包括：agrobacterium tumefaciens agl-1用于农杆菌质粒转化。将5μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至液氮中放置5min，然后再将感受态细胞放入37℃水浴锅温育5min。取出感受态，加入1ml无抗性yeb液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养2-3h。最后将50-100μl菌液涂布于yeb平板(50μg/ml car和50μg/mlkana)上，于28℃培养2天后，挑斑鉴定。

12、进一步的，所述步骤s3具体包括：将分生孢子、酵母态芽孢、冻存的酵母态芽孢、芽孢、感受态芽孢5种真菌分生孢子接种到含有1％麦芽糖、1％蛋白胨和1％酵母提取物的培养基中。25℃，180rpm振荡60h后，获得酵母样孢子。然后悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。然后，在5000转/分钟离心5分钟，收集孢子。再用5ml0.1m liac溶液悬浮菌体，混匀后于4000rpm离心5min，收集菌体。最后用500μl0.1mliac重悬菌体，混匀，各取50μl分装至1.5ml离心管，并置于-80℃保存备用。

13、进一步的，所述步骤s4具体包括：将鉴定无误的农杆菌接种至yeb液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养16-20h。离心收集菌体，并用im培养液重悬菌体至od660＝0.15。于28℃，250rpm震荡培养6h。稀释待转菌株分生孢子至107/ml。并将上述农杆菌菌液和真菌分生孢子悬浮液按比例1：1混匀，并涂布于im平板，避光干燥平板后置于25℃培养箱共孵育。5天后，用3-5ml无菌水洗涤并混匀培养物，取100μl涂布于sday和smay平板(含450μg/ml hygb和400μg/ml cefotaxime sodium)上，适当风干后，放入25℃培养，5-6天后挑选生长挑取转化子进行pcr鉴定。

14、分别用5种莱氏绿僵菌无性孢子与农杆菌进行共孵育，按照上述方法。分别计算他们的初次转化率。分别计数每个筛选平板上长出的转化子数量，每种无性孢子分别计数12个平板。无性孢子包括分生孢子，芽孢，冻存芽孢，芽生孢子和芽生孢子感受态。其中，冻存的芽生孢子和芽孢均是将成熟的芽生孢子和芽孢收集，冷冻干燥并保存一个月，放置-80℃超低温冰箱。

15、将所有筛选板上长出的单克隆挑出，转接至含有smay培养基的48孔板。并用引物对p5/p6进行pcr鉴定，计算正确单条带的克隆数占所有克隆数的比值(％)。

16、另一方面，本发明提出上述方法在莱氏绿僵菌功能基因的发掘和高毒力菌株的改造中的应用。

17、本发明的有益效果：

18、本发明通过感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育技术，成功地将莱氏绿僵菌的遗传转化效率提高到了一个新的高度。实验数据显示，冻存芽孢的转化成功率达到52％(nor_03501)，远高于现有方法中的最高成功率。这种方法优化了转化材料的选择，确保了更高的转化效率。莱氏绿僵菌在固体培养基上形成的芽孢其细胞壁较薄，更容易接受外源基因，这一特性为高效遗传转化提供了物理基础。此外，冻存芽孢在低温条件下稳定保存，能够保证转化材料的一致性和高质量，这种一致性直接提高了转化效率。根瘤农杆菌介导的转化方法通过其高效的t-dna转移机制，将目的基因高效整合到真菌基因组中，显著提高了遗传转化的效果。

19、本发明避免传统遗传转化方法中制备原生质体的繁琐步骤，通过根瘤农杆菌直接介导感受态芽孢的转化，大大简化了操作流程，缩短了实验周期。根瘤农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，atmt)不需进行细胞壁的去除和再生步骤，直接作用于完整的细胞，如感受态芽孢。这样不仅简化了操作流程，也避免了原生质体重建细胞壁带来的生理负担，确保更稳定的细胞活性，从而提高整个转化过程的效率和成功率。操作简便且可重复性高，使得大量转化实验可以在较短时间内完成，大大降低了实验周期和劳动强度。

20、本发明通过优化遗传转化方法，不仅提高了莱氏绿僵菌的遗传转化效率，还为该真菌的功能基因研究和高毒力菌株的改造提供了技术保障，推动了莱氏绿僵菌在生物防治及农业应用中的研究和实际应用前景。通过成功敲除莱氏绿僵菌中的关键基因nor_03501，并对其生长、发育、抗逆胁迫和毒力等表型进行详细研究，揭示了这些基因在真菌生理功能中的具体作用。这为进一步挖掘其他重要功能基因提供了技术手段。实验结果显示，基因缺失导致真菌在不同培养基上的生长速率、产孢量、化学胁迫抗性和对草地贪夜蛾的毒力均发生显著变化，这些发现为莱氏绿僵菌的功能基因组学研究和高毒力菌株的选育提供了新的理论基础。此外，利用冻存芽孢的高效遗传转化技术，可以在短时间内构建大量基因突变体，进一步加速了研究进程，为该真菌在生物防治中的广泛应用提供了重要支持。

21、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

技术特征：

1.一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括：由p-gtb载体改造而来的pgth被用于敲除工程菌株构建，大肠杆菌菌株dh-5α用于构建和二元载体的扩增；

3.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1还包括：pgth原始载体均使用xmai和bamhi限制性内切酶双酶切；酶切产物使用pcr产物纯化试剂盒纯化；将回收得到的载体骨架片段与目的基因的上游片段连接；转化至感受态大肠杆菌，筛选连接正确的阳性单菌落；一元载体pgth使用xbai和hpai限制性内切酶双酶切，酶切产物电泳分离，切胶回收载体骨架片段；将回收得到的载体骨架片段与酶切后的下游目的基因表达盒和下游目的基因表达盒连接；转化至感受态大肠杆菌；筛选连接正确的阳性单菌落；得到的目的基因的二元敲除载体。

4.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s2具体包括：agrobacterium tumefaciensagl-1用于农杆菌质粒转化；将5μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至液氮中放置5min，然后再将感受态细胞放入37℃水浴锅温育5min；取出感受态，加入1ml无抗性yeb液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养2-3h；最后将50-100μl菌液涂布于yeb平板上，于28℃培养2天后，挑斑鉴定。

5.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s3具体包括：将分生孢子、酵母态芽孢、冻存的酵母态芽孢、芽孢、感受态芽孢5种真菌分生孢子接种到含有1％麦芽糖、1％蛋白胨和1％酵母提取物的培养基中；25℃，180rpm振荡60h后，获得酵母样孢子；然后悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水中；然后，在5000转/分钟离心5分钟，收集孢子；再用5ml0.1 m liac溶液悬浮菌体，混匀后于4000rpm离心5min，收集菌体；最后用500μl0.1mliac重悬菌体，混匀，各取50μl分装至1.5ml离心管，并置于-80℃保存备用。

6.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s4具体包括：将鉴定无误的农杆菌接种至yeb液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养16-20h；离心收集菌体，并用im培养液重悬菌体至od660＝0.15；于28℃，250rpm震荡培养6h；稀释待转菌株分生孢子至107/ml；并将上述农杆菌菌液和真菌分生孢子悬浮液按比例1：1混匀，并涂布于im平板，避光干燥平板后置于25℃培养箱共孵育；5天后，用3-5ml无菌水洗涤并混匀培养物，取100μl涂布于sday和smay平板上，适当风干后，放入25℃培养，5-6天后挑选生长挑取转化子进行pcr鉴定；

7.如权利要求1-6任一项所述方法在莱氏绿僵菌功能基因的发掘和高毒力菌株的改造中的应用。

技术总结
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用，本发明通过根癌农杆菌的转化成功将莱氏绿僵菌菌株SZCY201010中NOR_03501基因敲除。通过感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育，将挑选的转化子的成功转化率提高到54％(NOR_03501)。同时，本发明对比了分生孢子、芽孢、冻存芽孢、芽生孢子和感受态芽孢的转化率，确定了利用感受态芽孢的遗传转化率是最高的。最后，还利用PCR、激光共聚焦荧光快速筛查、RT‑qPCR技术对真菌的转化子进行验证，验证了本技术的可靠性。

技术研发人员：彭跃进,陈斌,王广,张栩,杜广祖,王文倩
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23