一种利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法
本发明涉及生物，具体涉及一种利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法。
背景技术：
1、三七(panax notoginseng(burk)f.h.chen)又名田七，为五加科人参属植物，主要用于治疗冠心病和心血管类疾病，在止血、降压、抗血栓和神经保护等方面具有重要作用，在传统医学上具有很高的药用价值。近年来，三七广泛应用于药品、食品和化妆品领域。在中国，三七年需求量约为5000t，然而三七对生长条件要求苛刻，全世界仅云南省文山州以及广西部分地区适宜生长，加之生长周期长、病虫害严重、连作障碍、农药残留、种质资源退化等问题，三七资源难以满足市场上的需求。
2、通过组织培养技术，可快速繁殖三七种苗，缩短育种期限，优化种质资源，是有效解决上述问题的途径之一。
3、植物组织培养是指将植物的根、茎、叶、花、花药、生殖细胞等组织与器官，在无菌的条件下，置于人工配制的培养基，通过人工创造的条件获得完整植物体或其他生物产品的技术。在现有的三七组培研究报道中，一般使用三七的茎、叶作为外植体。在中国发明专利申请号：cn116711636.a中公开了一种以三七种子发芽后幼苗的茎或叶为外植体，通过三七胚性愈伤组织快速繁殖组培苗的方法；在中国发明专利申请号：cn201711451016.4中公开有一种三七花药愈伤组织的诱导方法，但是花药愈伤组织发芽诱导及生根诱导的方法尚未见报道，提高愈伤组织发芽率和生根率是花药愈伤组织快速分花形成组培苗的关键。
技术实现思路
1、本发明提供了一种利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，解决三七从种子到成苗的快速繁殖的技术问题，使用本发明的组织培养方法对三七植株的花药进行培养，愈伤组织的诱导率高，褐化程度低，同时，愈伤组织的分化效果好并能实现快速生根，因此，本发明的组织培养方法操作简便、成本低，可为快速繁殖三七种苗提供技术支持。
2、为了实现以上目的，本发明采取以下技术方案：
3、1、外植体无菌处理：剪取未开花的花序用自来水缓水流冲洗1h备用，在无菌条件下用75％酒精浸泡处理30～60秒，再用无菌水冲洗3次，接着用10％次氯酸钠溶液浸泡处理4～8分钟，期间摇晃3～5次，最后用无菌水冲洗5次后，无菌滤纸吸干水分，使用无菌的镊子从三七花中夹出花药备用；
4、2、三七胚性愈伤组织诱导：将无菌花药接种到愈伤诱导培养基上，25℃下暗培养30天，得到三七胚性愈伤组织，愈伤诱导培养基为添加1～3mg/l 2,4-d(2,4-苯氧乙酸)、1.5mg/l 6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、0.5g/l活性炭、0.5g/l pvp(聚乙烯比咯烷酮)、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8；
5、3、三七胚性愈伤组织增殖：将三七胚性愈伤组织接种在增殖培养基上，25℃下暗培养30～60天，获得大量的三七胚性愈伤组织，增殖培养基为添加2.0mg/l 2,4-d、0.5mg/l6-ba、0.5g/l pvp、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8；
6、4、三七胚性愈伤组织诱导成芽：将上述获得的三七胚性愈伤组织接种在芽诱导培养基上，12h/d光照培养至胚性愈伤组织分化成芽，芽诱导培养基添加1.0mg/l kt(人工合成的细胞分裂素)、0.5～1.0mg/l iba(吲哚丁酸)、0.5～1.0mg/l br(芸苔素内酯)、0.5g/lpvp、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8；
7、5、三七胚性愈伤组织生根诱导：将上述获得的长芽的胚性愈伤组织移到生根培养基中光照培养30d，生根培养基为添加1.0～3.0mg/l 2,4-d、0.5～1.5mg/l 6-ba、0.8mg/lkt、0.3g/l活性炭、pvp 0.5g/l、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8；
8、6、三七胚性愈伤组织成苗培养：将上述获得的组织移至成苗培养基中光照培养，形成完整的三七组培苗，成苗培养基为添加2.0mg/l kt、0.3g/l活性炭、pvp 0.5g/l、30g/l蔗糖的1/2ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
9、ms培养基中的琼脂添加量为8g/l。
10、上述芽诱导、生根诱导、芽诱导培养温度为23±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1600-2000lx。
11、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
12、本发明选取的是未开花的花序，先对花序进行预处理和灭菌处理后再取出花药，不仅有效降低了外植体的污染率，并且显著降低乙醇和次氯酸钠对花药的伤害，因此具有较好的愈伤组织诱导率。
13、采用本发明的愈伤诱导培养基进行外植体的培养，可有效促进愈伤组织的形成，诱导愈伤组织的成功率高；进一步，本发明使用了两种抗褐化剂，得到的愈伤组织褐化程度低，生长状态好；最后，采用本发明的生根培养基来对愈伤组织进行生根诱导，能实现快速生根。综上，采用本发明的组织培养方法来对三七植株的外植体进行培养，愈伤组织的诱导率高、愈伤组织生长状态好，同时，愈伤组织能实现快速生根，因此，本发明的组织培养方法操作简便、成本低，育种期限短，可有效为进一步种质资源的保存和优化提供技术支持，促进三七产业的发展。
技术特征：
1.一种利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于，无菌花药获取的具体过程如下：剪取未开花的花序用自来水缓水流冲洗1h，然后在无菌条件下用75％酒精浸泡处理，浸泡时间为30～60秒，再用无菌水冲洗3次，接着用5％～10％次氯酸钠溶液浸泡处理，浸泡处理时间为4～8分钟，最后用无菌水冲洗5次后，无菌滤纸吸干水分，使用无菌的镊子从三七花中夹出花药备用。
3.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：愈伤诱导培养基为添加1～3mg/l 2,4-d、1.5mg/l 6-ba、0.5g/l活性炭、0.5g/l pvp、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
4.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：增殖培养基为添加2.0mg/l 2,4-d、0.5mg/l 6-ba、0.5g/l pvp、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
5.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：步骤(3)中的芽诱导培养基为添加1.0mg/l kt、0.5～1.0mg/l iba、0.5～1.0mg/l br、0.5g/l pvp、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
6.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：生根培养基为添加1.0～3.0mg/l 2,4-d、0.5～1.5mg/l 6-ba、0.8mg/l kt、0.3g/l活性炭、pvp 0.5g/l、30g/l蔗糖的ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
7.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：成苗培养基为添加2.0mg/l kt、0.3g/l活性炭、pvp 0.5g/l、30g/l蔗糖的1/2ms基础培养基，ph为5.4-5.8。
8.据根权利要求1所述的根据权利要求1所述的利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，其特征在于：步骤(3)中光照培养温度为23±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为1600-2000lx。
技术总结
本发明公开一种利用三七花药愈伤组织快速繁殖组培苗的方法，以三年生三七花药为材料，经过外植体消毒、接种、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织增殖、胚性愈伤组织分化成苗的方法实现三七组织快繁，采用本发明的组织培养方法来对三七植株的外植体进行培养，愈伤组织的诱导率高、愈伤组织生长状态好，同时，愈伤组织能实现快速生根，因此，本发明的组织培养方法操作简便、成本低，育种期限短，可有效为进一步种质资源的保存和优化提供技术支持，促进三七产业的发展。
技术研发人员：刘源,王淑莹,杨千,杨野,王承潇,崔秀明
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23