一种耐高温漆酶突变体及其工程菌、制备与应用

本发明属于酶的基因工程，具体涉及一种耐高温漆酶突变体及其工程菌、制备与应用。

背景技术：

1、农业工业废物，如米糠、麦麸、甘蔗渣、玉米秸秆、花生壳废物，含有丰富的木质纤维素。目前，大多数废物被倾倒或焚烧，这会污染生态系统或减缓分解速度。因此，将这些木质纤维素转化为可有效消费的商品至关重要。作为可再生基质，木质纤维素被广泛研究用于生产还原糖和生物燃料，主要包括半纤维素、纤维素和木质素。为了释放纤维素和半纤维素，需要进行初步的木质素去除预处理。目前工业领域应用在去除木质素的工艺是纤维素利用的强碱高温制浆技术、半纤维素利用的强酸高温木糖（或糠醛）技术，这些工艺均存在环境污染带来的禁止或限制发展问题。

2、生物酶法替代强酸、强碱工艺降解木质素是解决污染、增加效益最有效的手段。然而，由于木质纤维素秸秆组成成分之间化学键的复杂性，利用具有专一属性单一酶降解木质素存在巨大的障碍。采用利用不同功能的酶复配为复合酶在同一场景下联合作用使木质素降解成为可能，目前已经有该技术方案进入产业化阶段，例如：专利cn 116479670 b等。

3、具有特定功能属性的木质素降解酶，如漆酶，它的自然酶学属性无法满足作为复合酶中特定场景应用的条件（如：温度、ph、酶活等）下发挥作用，需要通过漆酶突变体及其基因、工程菌和制备来实现这一目标。

4、漆酶(laccase，e.c.1.10.3.2)，又名酚酶，多酚氧化酶、漆酚氧化酶等，首次发现于漆树的汁液中，其特征是含有金属的氧化酶，它是有史以来最古老的酶之一。漆酶可催化氧化的底物有200多种，在漆酶催化氧化的过程中，t1cu是主要的电子受体。通过高度保守的his-cys-his三肽将电子转移到包含t2cu和t3cu原子的三核铜离子簇（tnc），然后将o2还原为 h2o，它能催化富含电子的底物与o2的单电子氧化反应，伴随着氧还原为完全无毒的水，这不仅绿色环保，而且底物特异性广泛。与木质素降解的传统方法相比，漆酶通过氧化酚类化合物的反应，将木质素分子中的酚环打开，进而导致木质素的链断裂。这一过程使得木质素分子的结构变得更加开放和活跃，提高了木质素的可降解性和可利用性。因此，漆酶的研究引起了广泛的关注。

5、漆酶的来源十分广泛，分为植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶与细菌漆酶，不同来源的漆酶发挥的作用也不同。目前，已商品化、研究较多和较深入的漆酶，大多被鉴定是来源于真菌，其中白腐真菌漆酶占比较多。真菌来源的漆酶在木质素降解、色素沉着、孢子形成、胁迫防御以及真菌-植物-病原/宿主相互作用等过程中发挥着重要作用。研究发现植物来源的漆酶可以促进植物的伤口愈合、参与

6、黄酮类化合物的代谢、维护细胞壁的结构完整性、响应盐胁迫和降解环境污染物等。与植物漆酶相比，针对昆虫来源漆酶的研究报道较少，昆虫漆酶在其角质层鞣化、硬化和色素沉积的生理过程对昆虫生长、发育、存活是必不可少的。细菌漆酶底物氧化范围非常广泛，在生物体内执行不同的功能。

7、目前国内外对真菌漆酶的研究较为广泛，研究发现大多数真菌漆酶在温和环境条件下能更好发挥作用，最适温度通常在 30-55 ℃之间，最适反应 ph 值为 4-6 之间，仅有个别为中性，耐高温，且真菌漆酶在高温和碱性条件下通常不稳定，限制了其应用。与真菌漆酶相比，细菌漆酶具有较好热稳定性、ph稳定性。其中芽孢杆菌来源的漆酶因具有相对较好的耐热性和碱稳定性而得到广泛的研究。在秸秆的工业降解过程中，往往需要高温辅助加速秸秆中有机物的分解和转化，‌生成可用的肥料或能源。因此在野生型芽孢杆菌漆酶基础上进一步提高其热稳定性，有利于其在工业上的应用。

8、蛋白质工程是指修改或创造具有期望功能或性质的蛋白质,如催化活性、结合亲和力、稳定性、溶解性、特异性或新颖性。蛋白质工程的两种主要方法是理性设计和非理性设计(或定向进化)。非理性设计(或定向进化)是指通过引入随机突变和重组，产生大量的蛋白质突变体文库,然后通过筛选或选择来寻找具有期望特性的蛋白质。

9、芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

10、毕赤酵母表达系统除了具有上述芽孢杆菌表达系统优势外，还具有真核表达优势：1、更接近哺乳动物的蛋白折叠和修饰，提高蛋白活性。2、高产量，适合高产量需求的项目。3、特别适用于需要复杂后转译修饰的蛋白。

11、因此，本发明中，通过对来源于短小芽孢杆菌（ bacillus pumilus）的漆酶基因进行突变，筛选得到热稳定性提高的漆酶突变体。随后利用芽孢杆菌和毕赤酵母表达系统，表达制备了耐高温突变体漆酶。

技术实现思路

1、基于漆酶高温应用场景的问题，为了获得热稳定性提升的漆酶，需对其现有性质作进一步改造，本发明的目的在于提供一种耐高温的漆酶突变体。将短小芽孢杆菌（ bacillus pumilus）来源的漆酶基因（ lac）在大肠杆菌bl21中进行表达；利用易错pcr技术对基因 lac突变，并利用abts对突变体进行筛选，选出热稳定性提高的突变体，实现了在枯草芽孢杆菌wb600、解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.11218、毕赤酵母gs115中表达制备。

2、实现本发明目的的技术路线概述如下：

3、对来自短小芽孢杆菌（ bacillus pumilus）的漆酶基因lac进行突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得突变体v347d/y463w及编码基因 lacm1，在80 ℃下的半衰期提高到野生型漆酶（lac）的151%。利用枯草芽孢杆菌wb600和毕赤酵母 gs115实现了最优突变体漆酶v347d/y463w的高效制备。

4、本发明提供的技术方案之一，是一种漆酶突变体，所述突变体是在seq id no.1所示野生型漆酶基础上，发生包含v347d和y463w的突变获得的，所述漆酶突变体命名为v347d/y463w突变体；

5、进一步地，所述v347d/y463w突变体，氨基酸序列如seq id no.3所示；

6、更进一步地，所述v347d/y463w突变体的编码基因 lacm1，核苷酸序列如seq idno.4所示。

7、本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；

8、进一步地，采用的表达载体为pet-28a(+)，宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，或者毕赤酵母；

9、更进一步地，宿主细胞为大肠杆菌bl21；

10、更进一步地，宿主细胞为枯草芽孢杆菌wb600，或者解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218，或者宿主细胞为毕赤酵母 gs115；

11、优选地，所述重组菌株是将突变体编码基因与表达载体pet-28a(+) 连接后在宿主大肠杆菌中表达所得。

12、本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株在生产技术方案一所述漆酶突变体中的应用。

13、本发明提供的技术方案之四，是技术方案一所述漆酶突变体的应用，特别是在降解木质纤维素中的应用；进一步地，是在降解秸秆或甘蔗渣中的应用；

14、进一步的，所述秸秆包括但不限于：玉米秸秆、水稻秸秆或小麦秸秆。

15、在本发明中采用如下定义：

16、1.氨基酸和dna核酸序列的命名法

17、使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用单字母或三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。

18、2. 漆酶突变体的标识

19、采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示lac突变体中突变的氨基酸。如v347d，表示位置347的氨基酸由野生型lac的val替换成asp，位置的编号对应于seq idno.1中野生型lac成熟肽的氨基酸序列编号。

20、在本发明中，lac代表野生型漆酶，v347d/y463w代表漆酶突变体，小写斜体 lac表示野生型漆酶lac的编码基因，小写斜体 lacm1表示突变体v347d/y463w的编码基因。

21、具体信息如下表。

22、

23、有益效果

24、本发明利用易错pcr技术对lac野生型进行突变，得到80℃下热稳定性相对于野生型提高的突变体v347d/y463w，在80 ℃下的半衰期提高到野生型漆酶（lac）的151%。

技术特征：

1. 一种漆酶突变体，其特征在于，所述漆酶突变体是在seq id no.1所示野生型漆酶基础上，发生v347d和y463w的突变获得的，氨基酸序列如seq id no.3所示。

2.权利要求1所述漆酶突变体的编码基因。

3.包含权权利要求2所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株。

4.权利要求3所述重组质粒或重组菌株在生产权利要求1所述漆酶突变体中的应用。

5.权利要求1所述漆酶突变体的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在降解木质纤维素中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素包括但不限于：秸秆、甘蔗渣。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述秸秆包括但不限于玉米秸秆、水稻秸秆或小麦秸秆。

技术总结
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种耐高温漆酶突变体及其工程菌、制备与应用。本发明将短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）来源的漆酶基因（lac）在大肠杆菌BL21中进行表达；利用易错PCR技术对基因lac突变，并利用ABTS对突变体进行筛选，选出热稳定性提高的突变体V347D/Y463W，实现了在枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218、毕赤酵母GS115中表达制备。

技术研发人员：刘逸寒,路福平,马向阳
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23