一种茶树茶饼病菌LAMP检测试剂、试剂盒及检测方法
本发明涉及茶树茶饼病菌检测，尤其涉及一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、茶饼病是由担子菌门( basidiomycota)、黑粉菌亚门( ustilaginomycotina)、外担菌纲( exobasidiomycetes)、外担菌目( exobasidiales)、外担菌科( exobasidiaceae)、外担菌属( exobasidium)下的坏损外担菌( exobasidiumvexansmassee）引起的。
2、茶饼病的典型特征是：病斑正面凹陷、平滑发亮，背面突起、呈馒头状，着生灰白色粉末，病害后期突起部萎缩成褐色枯斑，边缘有一圈灰白色，形似饼状，这也是“茶树疱状叶枯病”和“茶饼病”名称的由来，病害发生严重时，病部肿胀，卷曲畸形，因此该病也称为“茶树叶肿病”。
3、茶饼病主要在茶树幼嫩新梢上发病，如在四川茶区，从4月-8月，伴随降雨量增大，茶园湿度相对湿度较高，茶饼病易集中爆发，会导致茶叶产量5-10%的减产。茶饼病防治方法有农业防治、化学防治，虽然施用化学农药能有效地对茶饼病进行防治，但大量施用化学农药，会影响茶叶质量安全，并对环境和茶园有益生物带来危害。因此，茶饼病预测预报是茶饼病防控重要措施之一。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂、试剂盒及检测方法，根据茶饼病病原体坏损外担菌的its区域，设计了两个特异性外引物f3和外引物b3和两个特异性内引物fip和内bip，采用lamp技术，对茶饼病检测实现比pcr检测更高的灵敏度，并且使用肉眼或荧光染料来观察即可，适合于基层现场应用，为茶饼病的快速检测提供指导。
2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂，包括引物混合液、反应液、lamp特异性外引物f3和b3，内引物fip和bip；
3、所述引物混合液为10x引物混合液；
4、所述外引物f3的核苷酸序列为：aatctttgaacgcaccttg，所述外引物b3的核苷酸序列为：gcagatttcgatcacaagag，所述内引物fip的核苷酸序列为：accctctcgatccatctttagttaa ttggagcatgcctgtttg，所述内引物bip的核苷酸序列为：cttgggcttgcattggatgt aactctactgaaatccagct。
5、一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂盒，包括10x引物混合液和反应液，所述10x引物混合液由以下浓度引物构成：
6、ex-2-f32μm；外引物f3的核苷酸序列为：aatctttgaacgcaccttg；
7、ex-2-b32μm；外引物b3的核苷酸序列为：gcagatttcgatcacaagag；
8、ex-2-fip 16μm；内引物fip的核苷酸序列为：accctctcgatccatctttagttaattggagcatgcctgtttg；
9、ex-2-bip 16μm；内引物bip的核苷酸序列为：cttgggcttgcattggatgtaactctactgaaatccagct；
10、所述反应液由以下浓度液构成：
11、warmstart colorimetric lamp 2x master mix 12.5µl；
12、lamp primer mix (10x) 2.5µl；
13、target dna 1µl；
14、dh2o 9µl；
15、total volume 25µl。
16、一种茶树茶饼病菌lamp检测方法，包括以下步骤：
17、s1、将10x引物混合液和反应液高于常温孵育，孵育条件为65°c孵育45min。
18、所述10x引物混合液由以下浓度引物构成：
19、ex-2-f32μm；外引物f3的核苷酸序列为：aatctttgaacgcaccttg；
20、ex-2-b32μm；外引物b3的核苷酸序列为：gcagatttcgatcacaagag；
21、ex-2-fip 16μm；内引物fip的核苷酸序列为：accctctcgatccatctttagttaattggagcatgcctgtttg；
22、ex-2-bip 16μm；内引物bip的核苷酸序列为：cttgggcttgcattggatgtaactctactgaaatccagct；
23、所述反应液由以下浓度液构成：
24、warmstart colorimetric lamp 2x master mix 12.5µl；
25、lamp primer mix (10x) 2.5µl；
26、target dna 1µl；
27、dh2o 9µl；
28、total volume 25µl；
29、s2、肉眼检测：黄色为有扩增，红色或粉红色为无扩增。
30、本发明的有益效果是：本发明采用lamp技术，特异性强，比pcr检测方法有更高的灵敏度，不需昂贵的pcr仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用肉眼或荧光染料来观察即可，简单而快速，适合于基层现场应用。
技术特征：
1.一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂，包括引物混合液、反应液、lamp特异性外引物f3和外引物b3，内引物fip和内引物bip，其特征在于：
2.一种茶树茶饼病菌lamp检测试剂盒，其特征在于，包括10x引物混合液和反应液，所述10x引物混合液由以下浓度引物构成：
3.一种茶树茶饼病菌lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤s1中孵育条件为65°c孵育45min。
技术总结
本发明公开了一种茶树茶饼病菌LAMP检测试剂、试剂盒及检测方法，涉及茶树茶饼病菌检测技术领域。检测试剂包括引物混合液、反应液、LAMP特异性外引物F3和外引物B3，内引物FIP和内引物BIP。本发明通过设计的引物及采用LAMP技术进行茶饼病的检测，具有特异性强，比PCR检测方法有更高的灵敏度，不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用肉眼或荧光染料来观察即可，简单而快速，适合于基层现场应用，为茶饼病的快速检测提供技术指导。
技术研发人员：王小萍,李春华,向运佳,熊元元,蔡伟莉,张厅,王云,唐晓波
受保护的技术使用者：四川省农业科学院茶叶研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23