用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法与流程

本发明涉及透射电镜样品处理及制备，尤其涉及一种用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法。

背景技术：

1、神经系统中的髓鞘（myelin）结构位于神经元轴突的外围，紧紧包裹住轴突表面，其对神经元结构的支持、电信号的传递甚至能量代谢的维持都至关重要。髓鞘结构的形成与个体的认知、学习、记忆等生物过程密切相关，髓鞘结构的异常往往与多种神经系统疾病相关，因此，其微观结构对于理解神经系统的正常功能以及相关疾病的发生发展机制具有重要意义。透射电镜（tem）作为研究生物体超微结构的主要工具，其高分辨率和细节显示能力使其成为研究髓鞘超微结构表现的关键技术。

2、髓鞘是由特定类型神经胶质细胞产生的多层脂质膜结构，这些脂质膜环绕在轴突周围形成层次分明的致密绝缘层，是神经电信号能在神经元轴突上稳定而快速传导的结构基础。神经组织中的髓鞘结构非常脆弱，在提取的过程中极易受到拉扯挤压，组织灌注或固定的不充分，将导致髓鞘结构变形、松散甚至损坏，另外髓鞘的主要成分为脂质和蛋白质，灌注液和固定剂的选择配制极其关键，不恰当的固定无法保留样品中脂质和蛋白质的天然状态。另外，样品制备中的脱水过程是保证样品在真空中足够干燥并接受电子束照射的关键，快速的脱水会导致细胞和组织结构的过度变性和收缩，而过慢的脱水将延长整个样品制备的时间，导致样品表面或内部水分的不均匀残留以及引入空气泡，造成髓鞘层次不明显或者伪影的出现。另外，tem样品制备通常包括化学固定、脱水、浸渗、包埋等步骤，需要在各种不同溶液间置换，置换过程涉及液-液界面的接触和力的作用，髓鞘的脆弱结构在这些机械性操作中极易导致细胞或组织的物理损伤，使其变性，失去原有的形态和结构的完整性。

3、保持组织内部结构的完整性一直以来是制备透射电镜样品时普遍存在的技术问题，这在研究神经组织复杂而精密的髓鞘结构时尤为突出。因此，本发明提出了一种改进的神经组织透射电镜样品处理及制备方法，包括组织提取切割、灌注液和固定液的配制使用、脱水流程优化以及解决试剂溶液置换引起的机械力损伤等，旨在克服现有方法的挑战，确保髓鞘结构的完整性和真实性，提供更好的透射电镜图像质量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中关于神经组织透射电镜样品制样中髓鞘原有形态真实表现不足及其结构完整性缺陷的问题，提供一种用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法。本发明通过使用新型的灌注固定以及切割方法（包括采用新型灌注液、固定液以及低温浸润切割）、优化脱水流程的试剂比例和脱水速率以及擦镜纸包裹样品进行整体试剂溶液置换操作，维持了神经组织内部髓鞘原有的超微结构和形态表现，解决了神经组织透射电镜样品髓鞘变性的问题。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，包括以下步骤：

3、s1、固定、清洗：将神经组织样品放入体积浓度为2.5%的戊二醛固定液中，在20℃~25℃中避光固定2h，再放入4℃中固定过夜，再用浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液清洗3次，每次15min；

4、s2、二重固定、二重清洗：将步骤s1清洗后的神经组织样品完全浸没在体积浓度为1%的锇酸溶液中，4℃避光静置90~120min，再用浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液清洗3次，每次15min；

5、s3、脱盐、脱水：将步骤s3清洗后的神经组织样品使用擦镜纸包裹，依次用磷酸盐缓冲液的梯度稀释液浸泡包裹样品进行脱盐，再依次使用梯度浓度的乙醇、浓度为70%的乙醇铀、无水乙醇与丙酮混合液、浓度为100%的丙酮浸泡样品进行脱水；

6、s4、渗透包埋：将步骤s4脱水后的神经组织样品依次用不同比例的丙酮与树脂混合液各浸泡渗透90min，最后换新管并浸入纯树脂中，20℃~25℃过夜；

7、s5、梯度聚合：向包埋板孔中加入新鲜纯树脂，取出神经组织样品放入盛有树脂的包埋板孔中，整姿去泡，放入恒温箱中进行梯度聚合，24h后取出树脂包埋块，完成样品处理；

8、s6、修块切片：切割包埋块以使其切割面仅暴露目的样品，用超薄切片机和砖石刀进行超薄切片，并烤干；其中，超薄切片的厚度为50~70nm；

9、s7、染色、观察：对超薄切片进行染色处理，放置于铜网中，最后用透射电镜进行观察拍照，记录髓鞘超微结构。

10、进一步地，所述神经组织包括胼胝体、视神经、脊髓和坐骨神经。

11、进一步地，所述步骤s1中的固定液在使用时，其温度维持在20℃~25℃。

12、进一步地，所述步骤s3具体包括：将步骤s2清洗后的神经组织样品使用擦镜纸包裹，依次用浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液的梯度稀释液浸泡包裹样品进行脱盐，之后用双蒸水（ddh2o）清洗一下，再依次用梯度浓度的乙醇浸泡样品各15min，接着浸泡在浓度为70%的乙醇铀中，4℃过夜后，继续用梯度浓度的乙醇浸泡样品各15min，其中浓度为100%的乙醇浸泡样品脱水需进行两次；接着将样品依次用不同比例的无水乙醇与丙酮混合液再次浸泡脱水各15min；最后用浓度为100%的丙酮脱水两次，每次15min。

13、进一步地，所述pbs缓冲液的梯度稀释液的梯度稀释比例以及浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间分别为：pbs缓冲液与双蒸水的体积比为3:1，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为15min；pbs缓冲液与双蒸水的体积比为1:1，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为10min；pbs缓冲液与双蒸水的体积比为1:3，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为5min。

14、进一步地，所述步骤s3中，用于脱水的乙醇梯度浓度分别为30%、50%、70%、90%、100%。

15、进一步地，所述步骤s3中，无水乙醇与丙酮的体积比分别为3:1、1:1、1:3。

16、进一步地，所述步骤s3中，包裹样品使用的擦镜纸，需剪切成1cm*1cm大小，以保证能够完全包裹住样品即可。

17、进一步地，所述步骤s4中，丙酮与树脂的体积比分别为3:1、1:1、1:3。

18、进一步地，所述步骤s5具体包括：向包埋板孔中加入新鲜纯树脂，将样品取出放在滤纸上，吸干表面液体，使用沾有少量树脂的牙签尖端吸附干燥后的样品，由于此时样品脆弱，切勿夹取，放入盛有树脂的包埋板孔中，整姿去泡，以上全程在干燥灯照射下进行；最后放入恒温箱，恒温箱的温度设置为70℃，从20℃~25℃逐渐上升至70℃，进行梯度聚合，24h后取出树脂包埋块，完成样品处理。

19、进一步地，所述步骤s5中，整姿去泡具体为：调整包埋板孔中的样品的位置姿态，以使目的切面紧贴包埋板孔顶端，并垂直包埋板孔顶端切面，除去树脂中的气泡。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明使用新型的灌注固定以及切割方法、优化脱水流程的试剂比例和脱水速率以及擦镜纸包裹样品进行整体试剂溶液置换操作，维持了神经组织内部髓鞘原有的超微结构和形态表现；本发明通过使用新型组织取样和固定方法，即采用心尖灌注固定的方式取代直接取组织再体外固定的方式，使得组织初步固定更加彻底全面，满足后续组织修剪所需的硬度要求；新增将修剪后的组织放入室温固定液中，避光静置2h，再放入4℃过夜，结果证明获得紧实髓鞘电镜图像，解决了髓鞘结构松散问题；组织块进行固定、脱水脱盐等操作后，变得极脆，本发明将擦镜纸切成1cm*1cm大小，包裹住组织块，试剂置换过程只许夹取擦镜纸，避免了反复直接接触组织而引起的组织损坏风险，最大程度保证组织的完整性；另外，本发明根据髓鞘结构的特点，重新量身制定了二重固定、脱水脱盐以及渗透过程的处理方式和浸润时长，使最终得到的组织硬度适中，结构完整，获得的组织中髓鞘超微结构层次清晰紧实，无明显挤压拉扯所致的松散变性现象。

技术特征：

1.一种用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述神经组织包括胼胝体、视神经、脊髓和坐骨神经。

3.根据权利要求1所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的固定液在使用时，其温度维持在20℃~25℃。

4.根据权利要求1所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体包括：将步骤s2清洗后的神经组织样品使用擦镜纸包裹，依次用浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液的梯度稀释液浸泡包裹样品进行脱盐，之后用双蒸水清洗一下，再依次用梯度浓度的乙醇浸泡样品各15min，接着浸泡在浓度为70%的乙醇铀中，4℃过夜后，继续用梯度浓度的乙醇浸泡样品各15min，其中浓度为100%的乙醇浸泡样品脱水需进行两次；接着将样品依次用不同比例的无水乙醇与丙酮混合液再次浸泡脱水各15min；最后用浓度为100%的丙酮脱水两次，每次15min。

5.根据权利要求4所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的梯度稀释液的梯度稀释比例以及浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间分别为：磷酸盐缓冲液与双蒸水的体积比为3:1，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为15min；磷酸盐缓冲液与双蒸水的体积比为1:1，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为10min；磷酸盐缓冲液与双蒸水的体积比为1:3，对应的浸泡包裹样品进行脱盐的处理时间为5min。

6.根据权利要求4所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，用于脱水的乙醇梯度浓度分别为30%、50%、70%、90%、100%。

7.根据权利要求4所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，无水乙醇与丙酮的体积比分别为3:1、1:1、1:3。

8.根据权利要求1所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s4中，丙酮与树脂的体积比分别为3:1、1:1、1:3。

9.根据权利要求1所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s5具体包括：向包埋板孔中加入新鲜纯树脂，将样品取出放在滤纸上，吸干表面液体，使用沾有少量树脂的牙签尖端吸附干燥后的样品，放入盛有树脂的包埋板孔中，整姿去泡，以上全程在干燥灯照射下进行；最后放入恒温箱，恒温箱的温度设置为70℃，从20℃~25℃逐渐上升至70℃，进行梯度聚合，24h后取出树脂包埋块，完成样品处理。

10.根据权利要求9所述的用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，其特征在于，所述步骤s5中，整姿去泡具体为：调整包埋板孔中的样品的位置姿态，以使目的切面紧贴包埋板孔顶端，并垂直包埋板孔顶端切面，除去树脂中的气泡。

技术总结
本发明公开了一种用于髓鞘结构研究的神经组织透射电镜样品处理制备方法，该方法包括：首先对神经组织样品进行固定、清洗；再进行二重固定、二重清洗；然后进行脱盐、脱水；其次对样品进行渗透包埋；再进行梯度聚合；然后修块切片；最后染色、观察。本发明解决了在对神经组织进行电镜制样的过程中，柔软神经组织易受拉扯挤压、脱水效率导致的结构收缩以及髓鞘层次不明或者伪影问题、组织固定后机械性物理损伤问题，使最终得到的组织硬度适中，结构完整，髓鞘超微结构层次清晰紧实，无明显挤压拉扯所致的松散变性现象。

技术研发人员：陈翔,张宁,王子轩
受保护的技术使用者：之江实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23