一种寻找头颈部恶性肿瘤患者周围神经侵犯miRNA标志物的综合分析方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种寻找头颈部恶性肿瘤患者周围神经侵犯mirna标志物的综合分析方法。

背景技术：

1、头颈部肿瘤是我国比较常见的恶性肿瘤，约占到全身恶性肿瘤的20％-30％。头颈部肿瘤一般是指头颅底部到锁骨上，颈椎前的所有恶性肿瘤，比较常见的有鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、唇癌等，而临床上采用手术治疗、放射治疗，必要时也可以给予化疗。头颈部肿瘤是全世界第六大常见的恶性肿瘤，位于肿瘤相关死亡原因的第八位。头颈肿瘤发生的区域较为复杂，解剖部位深，通常难以开展常规手术或术后修复重建难度较高，患者生存质量差，对头颈肿瘤的诊疗一直是临床实践中的难点之一。周围神经侵犯(peripheralnerveinvasion，pni)最早在头颈部肿瘤中发现，肿瘤细胞常常会沿着神经纤维转移至颅内，从而影响患者预后；随后关于pni的研究在前列腺癌和其他疾病中也逐渐开展起来。但是作为最早发现有pni现象的肿瘤，pni在头颈部恶性肿瘤中作为一种新的生物学特征越来越受到人们的关注，但是相关研究刚起步，头颈部恶性肿瘤患者是否会发生周围神经侵犯的权威性标志物尤其是mirna类标志物尚未有权威报道。microrna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。大多数mirna基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。mirna可以通过破坏靶mrna的稳定性、抑制靶mrna的翻译来对靶mrna发挥调控作用，其是否可以作为神经侵犯的生物标志物及具体分析流程尚未有明确文献。基于此，我们利用生物信息学方法建立了一种寻找头颈部恶性肿瘤患者发生周围神经侵犯mirna标志物的综合分析方法，旨在确定头颈部恶性肿瘤患者发生pni的危险因素，并揭示pni对头颈部恶性肿瘤患者临床进展的影响，为构建特定标志物风险模型及治疗提供基础理论依据。

技术实现思路

1、本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，旨在寻找肿瘤是否会发生周围神经侵犯诊断mirna标志物中的应用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明首先从癌症基因组图谱tcga上下载原始mirnacount矩阵数据和临床特征，将其分为pni组和非pni组；随后使用r包deseq2分析在pni组和非pni组中的差异表达mirna，以校正后p<0.05且差异倍数的绝对值>1.2作为筛选差异mirna的阈值；使用r包clusterprofiler对差异mirna靶基因进行go和kegg富集分析；通过lasso交叉验证分析不同惩罚系数下模型的效果，选择准确度最高的参数建立模型，获得最关键的与pni表型相关的mirna；使用每个mirna的系数计算个体的风险评分；使用roc计算曲线下面积auc，以评估模型辨别能力；最后在测试集中验证模型的准确性。

4、进一步的，本发明的第一方面，提供一种肿瘤是否会发生周围神经侵犯相关mirna组合物，其特征在于，所述肿瘤发生周围神经侵犯的相关mirna组合物由10个特殊差异表达mirnahsa-mir-181a-2-3p、hsa-mir-411-3p、hsa-mir-206、hsa-mir-31-5p、hsa-mir-1266-5p、hsa-mir-598-3p、hsa-mir-25-3p、hsa-mir-200b-5p、hsa-mir-4746-5p、hsa-mir-30e-5p组成。

5、进一步的，所述的肿瘤包括但不限于头颈部恶性肿瘤。

6、进一步的，所述的表达水平指相关mirna的表达水平。

7、进一步的，所述的mirna表达水平的测定方法包括pcr、fish、rnascope、基因芯片、二代高通量测序中的任何一种或至少两种的组合。

8、进一步地，这种标志物可以用于不同的肿瘤病人群体，即对于一个新的群体，可以通过增加标本量，计算“预测分值”，找到阈值，在此基础上对后续的患者进行打分和对是否发生神经侵犯进行分析。

9、进一步地，所述检测产品包括：检测所述肿瘤是否发生周围神经侵犯相关mirna标志物组合物的探针和引物。

10、进一步地，所述检测产品包括：肿瘤发生周围神经侵犯相关mirna的探针和引物。所述探针能够通过分子杂交分别与所述特殊差异表达的周围神经侵犯相关mirna进行结合产生杂交信号，所述引物能够通过基于pcr的技术对所述特殊差异表达的周围神经侵犯相关mirna进行扩增。

11、本发明的检测产品中，除了针对上述mirna标记物的引物或探针之外，还可以追加含有用于pcr反应、试样的rna分离和cdna的合成的本领域公认的工具或试剂。

12、本发明的第三方面，提供一种如上所诉的肿瘤发生周围神经侵犯相关的mirna标志物组合物、所述的肿瘤发生周围神经侵犯相关mirna标志物组合物的检测产品在建立预测肿瘤是否发生周围神经侵犯风险预测系统中的应用。

13、本发明的第四方面，提供一种如上所诉的肿瘤发生周围神经侵犯相关mirna标志物组合物、所述的肿瘤发生周围神经侵犯相关mirna标志物组合物的检测产品在制备肿瘤发生周围神经侵犯预测产品中的应用。

14、进一步的，所述mirna表达水平的测定方法包括pcr、fish、rnascope、基因芯片、二代高通量测序中的任意一种或至少两种的组合。

15、这种模型可以用于不同的肿瘤病人群体，即对于一个新的群体，可以通过增加标本量，计算“预测分值”，找到阈值，在此基础上对后续的患者进行打分和进行分型。本发明保护应用该公式对不同群体进行检测计算并最终确定值。

16、与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：

17、本发明建立了具有10个周围神经侵犯相关mirna的标志物模型，并将头颈部恶性肿瘤患者分为pni组和非pni组。go和kegg结果显示差异mirna靶基因主要和神经活动受体-配体通路相关。roc曲线分析显示，auc高达0.752。预测性能已在测试集中得到验证。

18、本发明提出的判断头颈部恶性肿瘤发生周围神经侵犯mirna标志物组合的分析方法，为头颈部恶性肿瘤的临床治疗提供参考，可作为预测头颈部恶性肿瘤是否发生周围神经侵犯的新型mirna生物标志物和潜在治疗靶标。

19、说明书附图

20、为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

21、图1为本发明实施例中通过对pni组和非pni组进行mirna差异表达分析得到的所有差异表达mirna的火山图。

22、图2为本发明实施例中通过对pni组和非pni组进行差异表达分析得到的所有差异表达mirna的热图。

23、图3为本发明实施例中通过对pni组和非pni组进行差异表达分析得到的所有差异表达mirna靶基因的go富集通路图。

24、图4为本发明实施例中通过对pni组和非pni组进行差异表达分析得到的所有差异表达mirna靶基因的kegg富集通路图。

25、图5为本发明实施例中通过对pni组和非pni组进行差异表达分析得到的所有差异表达mirna经综合分析后得到的10个关键基因柱状图。

26、图6为本发明实施例中回归模型建立和验证中lasso系数曲线示意图。

27、图7为本发明实施例中回归模型建立和验证中用于调整lasso模型中参数选择的十次交叉验证示意图。

28、图8为本发明实施例中回归模型建立和验证中用于预测分类准确性的roc曲线示意图。

技术特征：

1.一种寻找头颈部恶性肿瘤患者周围神经侵犯mirna标志物的综合分析方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的构建一种寻找头颈部恶性肿瘤患者周围神经侵犯标志物的综合分析方法，其特征在于：所述10种神经侵犯相关mirna标志物为hsa-mir-181a-2-3p、hsa-mir-411-3p、hsa-mir-206、hsa-mir-31-5p、hsa-mir-1266-5p、hsa-mir-598-3p、hsa-mir-25-3p、hsa-mir-200b-5p、hsa-mir-4746-5p、hsa-mir-30e-5p。

3.根据权利要求1所述构建一种寻找头颈部恶性肿瘤患者周围神经侵犯标志物的综合分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.进一步的，所述的肿瘤包括但不限于头颈部恶性肿瘤。

5.进一步的，所述的表达水平包括但不限于mirna的表达水平。

6.进一步的，所述的mirna表达水平的测定方法包括pcr、fish、rnascope、基因芯片、二代高通量测序等中的任何一种或至少两种的组合。

7.这种模型可以用于不同的肿瘤病人群体，即对于一个新的群体，可以通过增加标本量，计算“预测分值”，找到阈值，在此基础上对后续的患者进行打分和进行mirna标志物表达水平分析。

技术总结
本发明公开了一种寻找头颈部恶性肿瘤患者是否会发生周围神经侵犯miRNA标志物的综合分析方法，属于生物技术领域。该方法包括：从TCGA某癌种队列中收集原始RNA测序数据和临床特征，随后分为PNI组和非PNI组；使用R包DESeq2分析在PNI组和非PNI组中的差异表达miRNA，以校正后P<0.05且差异倍数的绝对值>1.2作为筛选差异miRNA的阈值；对差异miRNA靶基因进行GO和KEGG通路富集分析；使用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归分析对差异miRNA进行分析；从LASSO分析中获得最关键的PNI相关miRNA；使用每个miRNA的系数计算个体化的风险评分；使用ROC计算曲线下面积AUC，以评估模型辨别能力；然后在测试集中使用相同风险评分公式验证模型的准确性；统计分析。该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合临床推广，通过该方法制备得到的miRNA标志物可用来进行头颈部恶性肿瘤是否会发生周围神经侵犯的分析，有利于深入研究头颈部恶性肿瘤的特性。

技术研发人员：张倩,潘宏伟
受保护的技术使用者：上海纽仁生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23