基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法及应用
本发明属于比色传感，涉及一种真菌毒素的纸基比色检测方法，具体涉及一种基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法及应用。
背景技术：
1、由于黄曲霉毒素污染食品供应，导致人口患肝细胞癌(hcc)的风险增加。真菌毒素污染对全球粮食安全、人类健康和环境构成了巨大威胁。由于传统方法通常需要多个分析步骤、繁琐的预处理、昂贵的仪器、耗时的程序以及对熟练技术人员的需求限制了其广泛应用，开发低成本、易操作、快速的检测和鉴别afb1的方法仍然是人们迫切需要的。双金属纳米酶纸基比色检测，由于其操作简单、成本效益、可视化以及现场应用等优点引起了人们广泛的关注，但目前的纸基检测方式普遍存在选择性低，灵敏度低，难以实现同时检测两个或多个样品的技术问题。因此，发展一种快速、可靠、简便的afb1化合物的多重测定方法至关重要。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低、操作简便、肉眼可见、可现场化检测、选择性高、灵敏度高的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法及应用。
2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
3、一种基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，包括以下步骤：
4、s1、核酸适配体修饰的双金属纳米酶uio66-nh2@pt/pd的制备：
5、s1.1、将氯化锆、2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸和盐酸溶于n,n-二甲基甲酰胺中，于80℃～200℃加热后得到uio66-nh2溶液；
6、s1.2、将氯铂酸钾和氯钯酸钠加入到uio66-nh2溶液中，随后投加抗坏血酸溶液，所得混合液干燥后，得到uio66-nh2@pt/pd；
7、s1.3、将步骤s1.2制得的uio66-nh2@pt/pd分散在醋酸钠-醋酸缓冲溶液中，得到a溶液，然后将核酸适配体加入a溶液中进行混合，得到核酸适配体修饰的uio66-nh2@pt/pd，为b溶液；
8、s2、检测单元的制备：将滤纸裁剪成多片纸基芯片，然后浸泡在b溶液中，再取出干燥，得到双金属纳米酶纸基检测芯片；
9、s3、样品检测：将含有不同浓度真菌毒素的样品分别滴加在多个双金属纳米酶纸基检测芯片上反应5min～30min，随后滴加含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，进行显色反应1min～20min；
10、s4、检测识别：利用手机对显色双金属纳米酶纸基检测芯片拍照，读取颜色强度并转换为rgb值，建立真菌毒素浓度与rgb之间的检测线性响应关系，并选取拟合度最高的曲线作为真菌毒素检测标准曲线；
11、s5、根据步骤s4所得真菌毒素检测标准曲线以及对含真菌毒素的待测样品测得的rgb值，得到待测样品中真菌毒素的浓度。
12、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s3中，当不含真菌毒素的样品滴加在双金属纳米酶纸基检测芯片上孵育时，滴加含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液进行反应，双金属纳米酶纸基检测芯片呈浅蓝色；当含真菌毒素的待测样品在纸基检测芯片上孵育时，滴加含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液进行反应，双金属纳米酶纸基检测芯片蓝色变深，由此定性检测待测样品中是否含有真菌毒素。
13、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，所述真菌毒素为黄曲霉毒素b1，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述真菌毒素浓度与双金属纳米酶纸基检测芯片显色rgb值的检测线性回归方程为：
14、r/g ＝ 0.6060 -0.0617 lgc (1)
15、式(1)中，r/g表示智能手机读取颜色转换的rgb值，c为待测样品中真菌毒素的浓度值，单位为ng/ml，式(1)的相关系数r2＝0.983，真菌毒素的检测线性范围为0.1ng/ml～1000ng/ml，检测限为0.09ng/ml。
16、上述的核酸适配体的核苷酸序列seq id no.1如下所示：
17、gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc
18、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s1.1中，所述氯化锆、2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸、盐酸和n,n-二甲基甲酰胺的比例为1mol∶1mol～5mol∶10mol～20mol∶0.5mol～2mol∶30ml～45ml。
19、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s1.1中，所述加热的时间为15h～30h。
20、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s1.2中，所述氯铂酸钾、氯钯酸钠、uio66-nh2和抗坏血酸在混合液中的质量浓度比为1～10∶1～2∶1∶10～30。
21、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s1.3中，所述uio66-nh2@pt/pd在醋酸钠-醋酸缓冲溶液中的浓度为50μg/ml～100μg/ml，所述醋酸钠-醋酸缓冲溶液的ph为2～5、醋酸钠浓度为0.1m～0.3m，所述核酸适配体在a溶液中的浓度为0.5μm～2μm。
22、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s2中，所述干燥的温度为2℃～40℃，所述干燥的时间为5min～25min。
23、上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，优选的，步骤s3中，所述含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，所述过氧化氢的浓度为5mm～20mm，所述tmb的浓度为0.5mm～2mm，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的ph为2～5、醋酸钠浓度为0.1m～0.3m。
24、作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法在检测环境或食品中真菌毒素的应用。
25、本发明中，tmb是指3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
26、本发明中，浓度单位m即表示mol/l。
27、本发明的检测原理主要在于：
28、本发明采用了具有优异的类过氧化物酶活性的uio66-nh2@pt/pd双金属纳米酶材料，该纳米酶能够在h2o2存在下催化tmb氧化显色为蓝色。利用核酸适配体功能化uio66-nh2@pt/pd，由于核酸适配体通过静电相互作用吸附在uio66-nh2@pt/pd双金属纳米酶材料上，掩盖了uio66-nh2@pt/pd的部分活性位点，导致uio66-nh2@pt/pd类过氧化物酶活性降低，从而抑制过氧化氢的分解，减弱对于底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化能力。另一方面，由于核酸适配体能够特异性识别目标物，更高的亲和性使适配体从uio66-nh2@pt/pd上解吸，渐渐恢复其类酶活性，使得纸基传感芯片颜色由浅蓝色变成深蓝色。结合核酸适配体提高uio66-nh2@pt/pd的选择性以及调控其酶活性，将核酸适配体功能化的uio66-nh2@pt/pd与纸基分析设备结合，纸基检测芯片产生的颜色变化通过智能手机读取识别，并转换为可读的rgb值，基于上述比色检测策略，在此基础上建立一个纸基载体检测平台实现真菌毒素(如黄曲霉毒素b1)的比色检测，从而达到目标物现场可视化、定性、定量检测的目的。
29、申请人发现，双金属颗粒虽然酶活性好，但是颗粒易通过其孔隙聚集和迁移导致容易团聚，加入mofs，可以固定金属颗粒，确保检测的稳定性与准确性。通常mofs为基底的纳米酶比色检测都是用于溶液检测体系中，在实际运用中难以保存，所使用的耗材很多，纸基体系虽然保存较方便、制作成本低且操作简单，但是纸基技术应用较多的是测流方法，即利用毛细管的吸附作用使样品在纸基材料上移动达到检测目的，而mofs负载双金属的材料流动性有限，所以通常认为其很难应用于纸基上。本发明创造性地将mofs负载双金属的材料应用于固定化的纸基上，使其流动性缺陷反而成为优势。本发明固定化的纸基原位检测技术相比现有纸基测流比色技术，对材料流动性需求不高，很大程度上能够避免假阳，且装置更为简单，也可同时读取多个位点数据，可实现更便捷高效的检测。
30、与现有技术相比，本发明的优点在于：
31、(1)本发明公开了一种基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，一方面，mofs(uio66-nh2)具有孔径均匀、框架结构设计合理、比表面积大等特点，但由于其粒径、流动性等原因，导致其在横向流动免疫分析技术(利用毛细管的吸附作用使样品在纸基材料上移动达到检测目的)的实际运用上受到限制，本发明将金属纳米颗粒加载到mofs上是强化mofs固有特性、赋予新功能和最大限度地减少贵金属使用的有利方法，防止金属颗粒通过其孔隙聚集和迁移，使得纳米酶材料可以在纸基装置上分布均匀且稳固，确保检测的稳定性与准确性，此外，mofs材料uio66-nh2上的-nh2为金属离子或金属配体配合物提供了良好的配位位点，因而可以将金属粒子材料负载在mofs上，运用到固定化纸基装置中，可以将mofs在横向流动免疫分析技术上的劣势转化为优势。同时，与单金属纳米酶相比，双金属纳米材料赋予了纳米酶更高的催化活性，将pt、pd金属粒子沉积在uio66-nh2形成具有显著类过氧化物酶活性的双金属纳米酶uio66-nh2@pt/pd，可实现在低含量(如10μg/ml)纳米酶条件下催化过氧化氢催化氧化显色底物，具有较高的检测灵敏度，并且该分析方法响应迅速，可在20min内实现对污染物的检测，极大地缩短了检测时间。另一方面，纳米酶的催化活性在核酸适配体锚定后可显著改变，从而可以影响显色底物的显色反应发生变化，再加入目标物后，基于适配体与目标物之间的特异性亲和，使得颜色变化与目标物浓度之间呈现一定关系，从而实现对目标物的测定。利用纸基将材料装载其上，不需要依靠大型检测设备，实现现场快速便捷检测，具有灵敏度高、操作简单、抗干扰能力强、检测范围宽和检测限低等优点，可应用于真菌毒素(如黄曲霉毒素b1)的特异性检测，具有很好的使用价值和应用前景。
32、(2)本发明的方法采用的优异类过氧化物酶催化活性的uio66-nh2@pt/pd纳米酶，通过简单的制备方法制得，相较于天然酶，纳米酶具有更好的稳定性、更低的生产成本、制备方便、高催化效率等优点，由于其高催化效率而被用作探针以提高其灵敏度。另外，相较于现有的纳米酶合成方法，本发明合成材料的方法更加简单，在当前资源匮乏的环境中，更加经济高效。同时，本方法不受特殊仪器和实验室限制的纳米酶比色传感技术与智能手机拍摄平台相结合的传感设备已成为便携式和用户友好模式下现场检测的一个有吸引力的候选技术，可实现同时检测多个样品，同时，随着当下对可持续发展目标的高度重视，便携式纸基传感器凭借其可降解且价格合理的性能，克服了溶剂介质的限制。因而，在此基础上，将纸基芯片排列在托盘上可同时读取检测多个样品，基于uio66-nh2@pt/pd的纸基检测芯片制备简单、价格低廉，可大大降低检测成本，并且利用普及性高的智能手机读取纸基颜色，能够实现迅速准确、可视化的现场检测，设备小巧便携，满足大众可操作性，适宜推广应用，克服了室内大型仪器检测分析的高成本、不能现场检测、需专业技术人员操作等局限性。该纸基比色传感器能够现场快速检测afb1中显示出巨大的应用潜力。
技术特征：
1.一种基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s3中，当不含真菌毒素的样品滴加在双金属纳米酶纸基检测芯片上孵育时，滴加含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液进行反应，双金属纳米酶纸基检测芯片呈浅蓝色；当含真菌毒素的待测样品在纸基检测芯片上孵育时，滴加含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液进行反应，双金属纳米酶纸基检测芯片蓝色变深，由此定性检测待测样品中是否含有真菌毒素。
3.根据权利要求1所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述真菌毒素为黄曲霉毒素b1，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述真菌毒素浓度与双金属纳米酶纸基检测芯片显色rgb值的检测线性回归方程为：
4.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s1.1中，所述氯化锆、2-氨基对苯二甲酸、苯甲酸、盐酸和n,n-二甲基甲酰胺的比例为1mol∶1mol～5mol∶10mol～20mol∶0.5mol～2mol∶30ml～45ml。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s1.1中，所述加热的时间为15h～30h。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s1.2中，所述氯铂酸钾、氯钯酸钠、uio66-nh2和抗坏血酸在混合液中的质量浓度比为1～10∶1～2∶1∶10～30。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s1.3中，所述uio66-nh2@pt/pd在醋酸钠-醋酸缓冲溶液中的浓度为50μg/ml～100μg/ml，所述醋酸钠-醋酸缓冲溶液的ph为2～5、醋酸钠浓度为0.1m～0.3m，所述核酸适配体在a溶液中的浓度为0.5μm～2μm。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s2中，所述干燥的温度为2℃～40℃，所述干燥的时间为5min～25min。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤s3中，所述含有tmb和h2o2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，所述过氧化氢的浓度为5mm～20mm，所述tmb的浓度为0.5mm～2mm，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的ph为2～5、醋酸钠浓度为0.1m～0.3m。
10.一种如权利要求1～9中任一项所述的基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法在检测环境或食品中真菌毒素的应用。
技术总结
本发明公开了一种基于双金属纳米酶纸基比色检测真菌毒素的方法及应用，方法包括先制备双金属纳米酶UiO66‑NH<subgt;2</subgt;@Pt/Pd，然后将核酸适配体修饰的UiO66‑NH<subgt;2</subgt;@Pt/Pd装载在纸基芯片上，再滴加不同真菌毒素浓度的样品进行反应，之后滴加含有TMB和H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;的显色剂进行显色反应，利用智能手机识别颜色强度获取RGB值，选取真菌毒素浓度与RGB值之间拟合度最高的线性曲线作为真菌毒素检测标准曲线，再根据所测样品的RGB值检测出真菌毒素的含量。本发明的方法具有成本低、操作简便、响应快速、抗干扰能力强、检测范围宽、可用于现场检测等优点，可应用于检测环境和食品中真菌毒素的残留。
技术研发人员：汤琳,卢雅婷,汤晶,朱旭,陈丽
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23