特异性结合Claudin18.2的抗体及其制法和应用的制作方法

本发明涉及工程化免疫治疗领域，具体地涉及特异性结合claudin18.2的抗体及其制法和应用。

背景技术：

1、claudin家族蛋白广泛分布于上皮细胞的紧密连接结构。claudin18.2具有四个跨膜区的膜蛋白，n端和c端在细胞质内，胞外有两个loop区，这两个胞外区可作为特异性靶点，用于靶向治疗。在正常组织中claudin18.2特异性表达于胃部高度分化的上皮细胞中，除了胃癌，也有高比例的胆管癌、卵巢癌、肺癌、食道癌和胰腺癌等肿瘤细胞中表达claudin18.2。

2、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car t)是一种针对肿瘤细胞表面特异性抗原的新型免疫治疗方法。目前，应用于开发实体瘤的细胞治疗。

3、骆驼源抗体的优势在于其性质稳定，水溶性好，免疫原性低，亲和力更强，分子量小，且能深入到抗原内部，组织穿透性强于传统抗体，可作为诊断工具，也可用于car-t和靶向药物的递送，来开发一种亲和力更高、特异性更强、免疫原性更低的car-t。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高亲和力和高生物活性的并能特异性识别的claudin18.1和/或claudin 18.2抗原的抗体及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种特异性结合claudin18.2的纳米抗体，所述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr区为选自下组：

3、(1)seq id no:36所示的cdr1、seq id no:37所示的cdr2、和seq id no:38所示的cdr3；

4、(2)seq id no:39所示的cdr1、seq id no:40所示的cdr2、和seq id no:41所示的cdr3；

5、(3)seq id no:42所示的cdr1、seq id no:43所示的cdr2、和seq id no:44所示的cdr3；

6、(4)seq id no:45所示的cdr1、seq id no:46所示的cdr2、和seq id no:47所示的cdr3；

7、(5)seq id no:48所示的cdr1、seq id no:49所示的cdr2、和seq id no:50所示的cdr3；

8、(6)seq id no:51所示的cdr1、seq id no:52所示的cdr2、和seq id no:53所示的cdr3；

9、(7)seq id no:39所示的cdr1、seq id no:54所示的cdr2、和seq id no:41所示的cdr3；

10、(8)seq id no:39所示的cdr1、seq id no:55所示的cdr2、和seq id no:41所示的cdr3；

11、(9)seq id no:67所示的cdr1、seq id no:68所示的cdr2、和seq id no:41所示的cdr3；

12、(10)seq id no:39所示的cdr1、seq id no:69所示的cdr2、和seq id no:41所示的cdr3；和/或

13、(11)seq id no:36所示的cdr1、seq id no:65所示的cdr2、和seq id no:66所示的cdr3。

14、在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

15、在另一优选例中，所述的特异性结合claudin18.2的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。

16、在另一优选例中，所述的特异性结合claudin18.2的纳米抗体的氨基酸序列如seqid no:1～26中任一所示。

17、在另一优选例中，所述纳米抗体的vhh链的氨基酸序列选自下组：seq id no:1～26、或其组合。

18、在另一优选例中，所述的纳米抗体vhh链的cdr区包含与seq id no:1～26任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述的纳米抗体vhh链cdr区的氨基酸序列与seq id no:1～26中任一相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。

20、在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与claudin18.2特异性结合能力的衍生序列。

21、在另一优选例中，所述claudin18.2为人或非人哺乳动物的claudin18.2。

22、在另一优选例中，所述claudin18.2为人、小鼠、大鼠、或非人灵长类动物(如猴)的claudin18.2。

23、在本发明的第二方面，提供了一种特异性结合claudin18.2的多价抗体或多特异性抗体，所述的多价抗体或多特异性抗体包括至少一个针对claudin18.2表位的抗体元件，所述抗体元件为本发明第一方面所述的抗claudin18.2纳米抗体。

24、在另一优选例中，所述抗claudin18.2多价抗体或多特异性抗体包括一个或多个抗claudin18.2纳米抗体。

25、在另一优选例中，所述抗claudin18.2抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。

26、在另一优选例中，所述抗claudin18.2抗体包括一条或多条具有如seq id no:1～26中任一所示的氨基酸序列的vhh链。

27、在另一优选例中，所述抗claudin18.2抗体包括两条具有如seq id no:1～26所示的氨基酸序列的vhh链。

28、在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

29、在本发明的第三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

30、(i)本发明第一方面所述的特异性结合claudin18.2纳米抗体、或本发明第二方面所述的特异性结合claudin18.2的多价抗体或多特异性抗体；以及

31、(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

32、在另一优选例中，所述的抗体为多价抗体。

33、在另一优选例中，所述的标签序列包括fc标签、ha标签、flag标签和6his标签。

34、在另一优选例中，所述的fc标签包含higg1fc和migg1fc。

35、在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于claudin18.1和/或claudin18.2蛋白。

36、在本发明的第四方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体(car)融合蛋白从n末端到c末端包含：

37、(i)特异性结合claudin18.2的抗原结合域，所述的抗原结合域含有本发明第一方面所述的纳米抗体；

38、(ii)跨膜结构域；

39、(iii)至少一个共刺激结构域；和

40、(iv)激活结构域。

41、在另一优选例中，所述的抗原结合域为单价或多价的。

42、在另一优选例中，所述的抗原结合域来自本发明第一方面所述的纳米抗体或本发明第三方面所述的重组蛋白。

43、在另一优选例中，所述的car具有式ia所示结构：

44、l-vhh-h-tm-c-cd3ζ   (ia)

45、式中，

46、各“-”独立地为连接肽或肽键；

47、l为信号肽序列；

48、vhh为特异性结合claudin18.2的抗原结合域；

49、h为铰链区；

50、tm为跨膜结构域；

51、c为共刺激信号结构域；

52、cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)。

53、在另一优选例中，所示l为选自下组的蛋白的信号肽：cd28、4-1bb、gm-csf、cd3、cd8a或其组合。

54、在另一优选例中，所述l为cd8来源的信号肽。

55、在另一优选例中，所述l包含如seq id no:27所示的氨基酸序列。

56、在另一优选例中，所述的vhh的氨基酸序列如seq id no:2、5、18所示。

57、在另一优选例中，所述的h包含如seq id no:28所示的氨基酸序列。

58、在另一优选例中，所述的tm包括cd28来源的跨膜区。

59、在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、4-1bb、cd8a或其组合。

60、在另一优选例中，所述的c包括4-1bb来源的共刺激信号分子。

61、在另一优选例中，所述的car融合蛋白具有seq id no：33-35所示的氨基酸序列。

62、在本发明的第五方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

63、(a)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、本发明第三方面所述的重组蛋白；以及

64、(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

65、在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

66、在本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的纳米抗体、或本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、本发明第三方面所述的重组蛋白、或本发明第四方面所述的car融合蛋白。

67、在本发明的第七方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第六方面所述的多核苷酸。

68、在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

69、在另一优选例中，所述表达载体为慢病毒载体。

70、在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第七方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第六方面所述的多核苷酸、或表达本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、本发明第三方面所述的重组蛋白、或本发明第四方面所述的car融合蛋白。

71、在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

72、在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

73、在另一优选例中，所述细胞为t细胞。

74、在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

75、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：

76、(i)嵌合抗原受体αβt细胞(car-t细胞)；

77、(ii)嵌合抗原受体γδt细胞(car-t细胞)；

78、(iii)嵌合抗原受体nkt细胞(car-nkt细胞)；

79、(iv)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)；

80、(v)嵌合抗原受体巨噬细胞。

81、在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将本发明第六方面所述的核酸分子或本发明第七方面所述的载体转导入t细胞或nk细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞，所述的工程化免疫细胞表达本发明第四方面所述的car融合蛋白。

82、在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测。

83、在本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、本发明第三方面所述的重组蛋白、本发明第四方面所述的car融合蛋白、或本发明第七方面所述的载体、或本发明第八方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

84、在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

85、在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

86、(i)本发明第一方面所述的纳米抗体、或本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、或本发明第三方面所述的重组蛋白、或表达本发明第四方面所述的car融合蛋白的免疫细胞；以及

87、(ii)药学上可接受的载体。

88、在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。

89、在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有其他的治疗免疫系统疾病或肿瘤疾病的药物。

90、在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗与claudin18.2相关的疾病或病症的药物。

91、在另一优选例中，所述的与claudin18.2相关的疾病或病症选自下组：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、或其组合。

92、在本发明的第十二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第六方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组蛋白或本发明第七方面所述的载体。

93、在另一优选例中，所述试剂盒用于制备表达本发明第四方面所述的受体car融合蛋白的免疫细胞。

94、在本发明的第十三方面，提供了本发明第一方面所述的纳米抗体、或本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、或本发明第三方面所述的重组蛋白、或表达本发明第四方面所述的car融合蛋白的免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗与claudin18.2相关的癌症或肿瘤的药物。

95、在本发明的第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用：本发明第一方面所述的纳米抗体、或本发明第二方面所述的多价抗体或多特异性抗体、或本发明第三方面所述的重组蛋白、或表达本发明第四方面所述的car融合蛋白的免疫细胞。

96、在另一优选例中，所述疾病为claudin18.2表达阳性的癌症或肿瘤。

97、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种特异性结合claudin18.2的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr区为选自下组：

2.一种特异性结合claudin18.2的多价抗体或多特异性抗体，其特征在于，所述的多价抗体或多特异性抗体包括至少一个针对claudin18.2表位的抗体元件，所述抗体元件为权利要求1所述的抗claudin18.2纳米抗体。

3.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

4.一种嵌合抗原受体(car)融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体(car)融合蛋白从n末端到c末端包含：

5.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的纳米抗体、或权利要求2所述的多价抗体或多特异性抗体、权利要求3所述的重组蛋白、或权利要求4所述的car融合蛋白。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸、或表达权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的多价抗体或多特异性抗体、权利要求3所述的重组蛋白、或权利要求4所述的car融合蛋白。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

10.权利要求1所述的纳米抗体、或权利要求2所述的多价抗体或多特异性抗体、或权利要求3所述的重组蛋白、或表达权利要求4所述的car融合蛋白的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗与claudin18.2相关的癌症或肿瘤的药物。

技术总结
本发明涉及特异性结合Claudin18.2的抗体及其制法和应用。具体地，本发明提供了一种抗Claudin18.2纳米抗体或其结合片段。本发明的抗体具有良好的特异性，并且所述抗体和将该抗体用于制备靶向Claudin18.2的免疫效应细胞，在治疗或改善Claudin18.2阳性表达的疾病，表现出良好的治疗效果。

技术研发人员：董琦,沈连军,殷文劼,曹卫
受保护的技术使用者：亘喜生物科技（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23