本发明属于脂肪酸发酵领域,具体涉及一种生产游离脂肪酸重组大肠杆及构建方法和用途。
背景技术:
1、生物燃料具有环境友好和可再生等显著优点,因此油脂有望成为石化产品的替代产品,目前油脂的主要来自来自植物油和动物脂肪,其可用性有限,因此微生物细胞工厂的应用引起了广泛关注。其中游离脂肪酸可以作为中间体转化生成各种燃料和工业化学品,例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪醇、烯烃等,这使游离脂肪酸和脂肪酸衍生化学品成为石油燃料的有吸引力的替代品。
2、游离脂肪酸(ffas)是一类用于各种应用的基本分子,包括生物燃料、聚合物和表面活性剂的生产。然而,目前生产ffas的方法昂贵且效率低下,这导致寻找替代方法进行合成。合成生物学为设计微生物(如大肠杆菌)提供了机会,以高效且经济地生产ffas。与传统生产方法相比,大肠杆菌在合成生物学中合成的ffas具有几个优点。使用大肠杆菌生产ffa具有成本效益,可持续,可扩展,并提供高产量的ffa。大肠杆菌中脂肪酸生物合成途径的灵活性允许生产具有特定特性的ffa,这些ffa可根据所需应用量身定制。利用合成生物学对大肠杆菌进行工程设计以生产ffas,是开发具有成本效益和可持续的ffas来源用于各种应用的有前途的方法。
3、在改路径的现有基础上挖掘大肠杆菌合成脂肪酸的潜力很难,所以分析研究非路径基因是非常有意义的。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
2、本发明的第二个目的是提供上述生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法。
3、本发明的第三个目的是提供上述生产游离脂肪酸重组大肠杆菌合成游离脂肪酸的用途。
4、本发明的第四个目的是提供第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
5、本发明的第五个目的是提供上述第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法。
6、本发明的第六个目的是提供上述第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌合成游离脂肪酸的用途。
7、本发明的技术方案概述如下:
8、生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法,包括如下步骤:
9、(1)将靶向大肠杆菌mg1655(de3)内源基因acrd的acrd_2252片段与ptargetf_lac_prelib质粒酶切连接,构建重组质粒pacrd_2252;
10、所述基因acrd的核苷酸序列如seq id no.15所示;
11、所述acrd_2252片段的核苷酸序列如seq id no.16所示;
12、(2)以重组质粒pacrd_2252为模板,以sg-acrd_2252-f和sg-acrd_2252-r为上、下游引物,扩增得到sg-acrd_2252表达盒;
13、所述sg-acrd_2252-f的核苷酸序列如seq id no.17所示;
14、所述sg-acrd_2252-r的核苷酸序列如seq id no.18所示;
15、所述sg-acrd_2252表达盒的核苷酸序列如seq id no.19所示;
16、(3)将sg-acrd_2252表达盒酶切链接到重组质粒pcfp,构建重组质粒pcfpa;
17、所述pcfpa质粒的核苷酸序列如seq id no.20所示;
18、(4)将重组质粒pcfpa转化到合成游离脂肪酸重组大肠杆菌底盘mg1655(de3)-δfade中,得到重组大肠杆菌pcnbi-acrdi。
19、上述构建方法构建的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
20、上述生产游离脂肪酸重组大肠杆菌生产游离脂肪酸的用途。
21、第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法,包括如下步骤:
22、(1)以大肠杆菌mg1655(de3)基因组为模板,以ndei-fadr-f和nhei-fadr-r为上、下游引物,扩增fadr基因得到片段ndei-fadr-xhoi;
23、所述ndei-fadr-f的核苷酸序列如seq id no.21所示;
24、所述nhei-fadr-r的核苷酸序列如seq id no.22所示;
25、所述fadr基因的核苷酸序列如seq id no.23所示;
26、所述片段ndei-fadr-xhoi的核苷酸序列如seq id no.24所示;
27、(2)将ndei-fadr-xhoi片段酶切连接到质粒sg-bad,构建重组质粒pbad_fadr;
28、所述质粒sg-bad的核苷酸序列如seq id no.25所示;
29、所述重组质粒pbad_fadr的核苷酸序列如seq id no.26所示;
30、(3)将重组质粒pbad_fadr转化到重组大肠杆菌pcnbi-acrdi中,得到生产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株pcnbi-acrdi-pbad_fadr。
31、上述第二种构建方法构建的第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
32、上述第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌生产游离脂肪酸的用途。
33、本发明的优点:
34、本发明的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株pcnbi-acrdi能够通过调控细胞内源与脂肪酸代谢非直接相关的基因的表达以甘油为碳源高效合成游离脂肪酸,试管培养得到4120mg/l游离脂肪酸,相对于菌株cf提高了451%。
35、本发明的第二种生产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株pcnbi-acrdi-pbad_fadr能够在路径和非路径调控的方式进一步以甘油为碳源高效合成游离脂肪酸。
36、本发明构建的合成游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株pcnbi-acrdi-pbad_fadr游离脂肪酸产量可达5093mg/l,相对于菌株cf和pcnbi-acrdi分别提高了582%和24%。
1.生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:
2.生产游离脂肪酸重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:
3.权利要求1的构建方法构建的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
4.权利要求2的构建方法构建的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌。
5.权利要求3的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌生产游离脂肪酸的用途。
6.权利要求4的生产游离脂肪酸重组大肠杆菌生产游离脂肪酸的用途。