诱导多能干细胞分化为CD34+造血干祖细胞的培养基组合的制作方法
本发明涉及细胞工程，具体涉及一种诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的方法及其培养基组合。
背景技术：
1、多能干细胞(pluripotent stem cells)具有自我更新能力以及多谱系分化潜能，具有分化几乎所有细胞类型的能力，包括造血干/祖细胞(hspc)以及成熟造血细胞。hspc通过进一步分化可在体外及体内产生多种血细胞，如髓系(my)、红系(er)和巨核细胞(mk)，以及更重要的免疫细胞，如nk细胞、t细胞，从而具有治疗疾病的潜力。近年来，多种免疫细胞，如nk细胞，细胞毒性t细胞，treg细胞，巨噬细胞，和嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor,car)结合起来，可产生car-nk，car-t，car-treg，car-macrophage等工程化免疫细胞，用于治疗肿瘤，感染性疾病，自身免疫性疾病。因此，多能干细胞可结合car以及定向分化技术，通过定向分化获得hspc，并进一步分化为car-nk，car-t，car-treg，car-macrophage等工程化免疫细胞。
2、同时，hspc移植和造血细胞输注也成功治愈了一些患者，尤其是恶性血液病患者。由于供体短缺和细胞数量有限，多能干细胞诱导获得hspc也可作为造血干细胞移植的替代来源。
3、然而现有的诱导多能干细胞分化为hspc和nk细胞的方法，获得的cd34+细胞群体比例较低；非3d状态诱导，不适合工业化生产；仍使用了滋养层细胞(mef)，不适用于临床应用；多能干细胞分化而来的hspcs分化效率和产量相对较低。
4、因此，诱导多能干细胞分化为hspc和nk细胞的培养基组分以及方法有待改进。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞或nk细胞的方法及其培养基组合。本发明提供的培养方法获得的nk细胞纯度高，体外扩增效果好；ink细胞产量高，单个ipsc可分化获得约2000个nk细胞；获得的ink高表达cd16(超过70％)，解决了现有技术ink cd16表达量低，需通过基因修饰方法解决cd16低表达的问题。
2、为此，本发明第一方面提供一种诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合。根据本发明的一些实施方案，所述培养基组合包括第一分化培养基、第二分化培养基以及第三分化培养基，所述第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基分别在第一分化阶段、第二分化阶段、第三分化阶段加入，
3、(1)所述第一分化培养基包括第一基础培养基；和
4、bmp4、gsk-3β抑制剂；
5、(2)所述第二分化培养基包括第二基础培养基；和
6、任选地um171，且不含有il-3；
7、(3)所述第三分化培养基包括第三基础培养基；和
8、vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo，且不含有il-3。
9、现有的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养条件复杂(如分化过程需要提供低氧培养条件，或需额外分选富集步骤以获得高纯度hsc，或含2d培养步骤，不适合密闭培养体系)，多能干细胞分化而来的hspcs分化效率和产量相对较低。发明人发现，第一分化培养基中添加bmp4或gsk-3β抑制剂，或其组合显著加快hspc分化进程并提升cd34表达。优选地，还可以结合轨道摇床成球或aggrewell成球方式，可以获得高纯度的cd34+细胞。um171仅在第二分化培养基中添加才能获得最好的cd34+分化效率和最好的hspcs产量。
10、根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞。
11、根据本发明的一些实施方案，所述第一基础培养基包括选自mtesrtm1、tesrtm2、tesrtm-aof、essential 8tm培养基、hesc xf、feeder-free stem cellculture media中的至少之一。
12、根据本发明的一些实施方案，所述第一基础培养基为mtesrtm1或tesrtm-aof培养基。
13、根据本发明的一些实施方案，所述第二基础培养基为stemprotm-34sfm完全培养基。
14、根据本发明的一些实施方案，所述第三基础培养基为stemprotm-34sfm完全培养基。
15、根据本发明的一些实施方案，所述第一分化培养基进一步包括rock抑制剂。
16、根据本发明的一些实施方案，所述rock抑制剂包括选自y27632、hb-100中的至少之一。
17、根据本发明的一些实施方案，所述第二分化培养基进一步包括vegf、bfgf、bmp4。
18、根据本发明的一些实施方案，所述第二分化培养基进一步包括诱导增强剂。
19、根据本发明的一些实施方案，所述诱导增强剂包括选自gsk-3β抑制剂、sr1。
20、根据本发明的一些实施方案，所述gsk-3β抑制剂包括chir99021、np031112、at7519、tws119、sb216763、chir-98014、azd1080、sb415286、ly2090314、(e/z)-gsk-3βinhibitor 1、ky19382、alsterpaullone、bio-acetoxime、im-12、1-azakenpaullone、indirubin。
21、根据本发明的一些实施方案，所述第二分化培养基进一步包括its-x、β-巯基乙醇、抗坏血酸、glutamax。
22、根据本发明的一些实施方案，所述第三分化培养基进一步包括its-x、β-巯基乙醇、抗坏血酸、glutamax。
23、根据本发明的一些实施方案，所述bmp4的使用浓度为5ng/ml-100ng/ml。
24、根据本发明的一些实施方案，所述gsk-3β抑制剂为chir99021，所述chir99021的使用浓度为1μm-20μm。
25、根据本发明的一些实施方案，所述rock抑制剂为y27632，所述y27632的使用浓度为1μm-20μm。
26、根据本发明的一些实施方案，所述vegf的使用浓度为5ng/ml-100ng/ml。
27、根据本发明的一些实施方案，所述bfgf的使用浓度为5ng/ml-100ng/ml。
28、根据本发明的一些实施方案，所述scf的使用浓度为5ng/ml-100ng/ml。
29、根据本发明的一些实施方案，所述tpo的使用浓度为1ng/ml-100ng/ml。
30、根据本发明的一些实施方案，所述flt3l的使用浓度为1-200ng/ml，优选1-50ng/ml。
31、根据本发明的一些实施方案，所述um171的使用浓度为0nm-1μm。
32、根据本发明的一些实施方案，所述诱导增强剂为sr1，所述sr1的使用浓度为0μm-2μm。
33、本发明第二方面提供一种诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合。根据本发明的一些实施方案，所述培养基组合包括第四分化培养基以及第一方面所述的培养基组合中的第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基，
34、所述第四分化培养基包括第四基础培养基；和
35、il-7、il-15、flt3l、scf，任选地il-3；
36、且所述第二分化培养基中添加um171，
37、任选地，所述第二或第三分化培养基中添加sphk2抑制剂。
38、根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞。
39、根据本发明的一些实施方案，所述第四基础培养基为dmem/f12。
40、根据本发明的一些实施方案，所述sphk2抑制剂为abc294640。
41、根据本发明的一些实施方案，所述abc294640的使用浓度为1-50μm。
42、根据本发明的一些实施方案，所述il-3的使用浓度为0–10ng/ml。
43、根据本发明的一些实施方案，所述il-7的使用浓度为0.1-30ng/ml。
44、根据本发明的一些实施方案，所述il-15的使用浓度为1-10ng/ml。
45、根据本发明的一些实施方案，所述flt3l的使用浓度为1-200ng/ml，优选1-50ng/ml。
46、根据本发明的一些实施方案，所述scf的使用浓度为5ng/ml-100ng/ml。
47、根据本发明的一些实施方案，所述第四分化培养基进一步包括血清替代物、人ab血清、fbs中的至少之一以及人血白蛋白。
48、根据本发明的一些实施方案，所述第四基础培养基进一步包括nad+、hla-c、sb203580、il-2中的至少之一。
49、根据本发明的一些实施方案，所述nad+的使用浓度为1–500μm。
50、根据本发明的一些实施方案，所述hla-c的使用浓度为0.05ng/ml-1ng/ml。
51、根据本发明的一些实施方案，所述sb203580的使用浓度为1μm-50μm。
52、根据本发明的一些实施方案，所述il-2的使用浓度为100-5000iu。
53、本发明第三方面提供第一方面所述的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合、第二方面所述的诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合在制备nk细胞中的用途。
54、本发明第四方面提供一种制备cd34+造血干/祖细胞的方法。根据本发明的一些实施方案，所述方法包括：
55、a.获取单细胞状态的多能干细胞；
56、b.将所述单细胞状态的多能干细胞置于第一培养条件下培养，获得第一细胞球；
57、c.将所述第一细胞球置于第二培养条件下培养，获得第二细胞球；
58、d.将所述第二细胞球置于第三培养条件下培养，获得cd34+造血干/祖细胞，
59、其中，所述第一培养条件包括利用第一分化培养基对所述多能干细胞进行分化培养，
60、所述第二培养条件包括利用第二分化培养基对所述第一细胞球进行分化培养，
61、所述第三培养条件包括利用第三分化培养基对所述第二细胞球进行分化培养，
62、所述第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基为第一方面所述的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合中的第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基，
63、所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞。
64、本发明提供了一种分化多能干细胞以获得cd34+细胞(hspcs)的方法。所述方案采用3d连续培养的方式，该类cd34+细胞同时表达cd43和cd44，本方法从消化为单细胞的多能干细胞开始，将多个多能干细胞转移至第一分化培养基中形成第一球体。然后第一球体依次使用第二和第三分化培养基培养形成第二球体和第三球体。其中，第二球体和第三球体可在密闭系统中培养。以上步骤共耗时6-14天，hspcs来自从第三球体中掉落的悬浮细胞。将上述hspcs和第三球体继续培养，可获得nk细胞(ink)。该方案适用于常规co2浓度条件下培养，不需要低氧培养条件，无中间分选富集步骤即可获得超过90％纯度的cd34+cd43+、cd34+cd44+细胞群，分化过程中无滋养层细胞，适用于临床用细胞制备。
65、本发明第五方面提供一种cd34+造血干/祖细胞，所述cd34+造血干/祖细胞通过第四方面所述的方法获得。
66、本发明第六方面提供一种制备nk细胞的方法，根据本发明的一些实施方案，所述方法包括：
67、a.利用第四方面所述的方法获得cd34+造血干/祖细胞；
68、b.将所述cd34+造血干/祖细胞置于第四培养条件下培养，获得nk细胞，
69、所述第四培养条件包括利用第四分化培养基对所述cd34+造血干/祖细胞进行分化培养，
70、所述第四分化培养基为前面所述的诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合中的第四分化培养基，
71、且第四方面所述的方法中使用的第二分化培养基中添加um171；
72、任选地，所述第二或第三分化培养基中添加sphk2抑制剂。
73、现有的ink分化过程中依赖滋养层细胞，不适于临床应用；ink细胞cd16表达量较低(一般多为20-30％)(zhu,huang et al.“pluripotent stem cell-derived nk cellswith high-affinity noncleavable cd16a mediate improved antitumor activity.”blood vol.135,6(2020):399-410)，限制了ink的抗体依赖的细胞毒作用(adcc)。本方案旨在建立一种高效获得hspc的方法，并可进一步分化为nk细胞，且1)培养条件简便(常氧培养，无额外分选富集步骤，全程3d培养)；2)培养基无血清，ink分化过程中无需滋养层细胞，适用于临床应用。3)hspcs纯度高，且产量高(最高可获得99％以上纯度的cd34+细胞)；4)cd16表达显著提升，可达70％以上。5)ink产量高，分化过程结束时可获得相对于ipsc高达2000倍的扩增。且发明人发现第二分化培养基中添加um171，第二或第三分化培养基中添加sphk2抑制剂可显著提升后续ink的产量。第四分化培养基添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、或hla-c、或sb203580、或il-2，可提升ink的产量而不影响cd56+或cd45+细胞的比例。
74、根据本发明的一些实施方案，所述um171使用浓度为1nm-1μm。
75、根据本发明的一些实施方案，所述um171的使用浓度为35nm。
76、根据本发明的一些实施方案，所述sphk2抑制剂包括abc294640。
77、根据本发明的一些实施方案，所述abc294640的使用浓度为1-50μm。
78、本发明第七方面提供一种nk细胞。根据本发明的一些实施方案，所述nk细胞通过第六方面所述的方法获得。
79、本发明第八方面提供第一方面所述的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合、第二方面所述的诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合、第四方面所述的制备cd34+造血干/祖细胞的方法制备获得的cd34+造血干/祖细胞、第五方面所述的cd34+造血干/祖细胞、第六方面所述的制备nk细胞的方法制备获得的nk细胞、第七方面所述的nk细胞在制备car-nk细胞中的用途。
80、本发明第九方面提供一种car-nk细胞。根据本发明的一些实施方案，所述car-nk细胞通过以下方法获得：对多能干细胞进行改造或基因编辑，获得具有表达car的多能干细胞，利用第六方面所述的制备nk细胞的方法对所述car修饰的多能干细胞进行分化培养，获得car-nk细胞。
81、根据本发明的一些实施方案，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞。
82、本发明第十方面提供一种细胞群。根据本发明的一些实施方案，细胞群含有第七方面所述的nk细胞和/或第九方面所述的car-nk细胞。
83、本发明第十一方面提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物。根据本发明的一些实施方案，所述药物包含第七方面所述的nk细胞和/或第九方面所述的car-nk细胞和/或第十方面所述的细胞群。
84、本发明技术方案具有以下有益效果：
85、1)培养条件简单，常氧条件下即可，不需要低氧培养；
86、2)可平均获得纯度约为94％纯度的cd34+细胞；
87、3)可平均获得70倍以上初始多能干细胞数量的cd34+细胞；
88、4)进一步分化获得nk细胞纯度高，体外扩增效果好；
89、5)分化过程全程3d培养，适应封闭化培养系统；
90、6)ink细胞产量高，单个ipsc可分化获得约2000个nk细胞；
91、7)本方案获得的ink高表达cd16(超过70％)，解决了现有技术ink cd16表达量低，需通过基因修饰方法解决cd16低表达的问题；
92、8)获得的ink可以用于治疗血液瘤和实体瘤；
93、9)ink可以装载car，并行使特异性杀伤。
94、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
技术特征：
1.一种诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合，其特征在于，包括第一分化培养基、第二分化培养基以及第三分化培养基，所述第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基分别在第一分化阶段、第二分化阶段、第三分化阶段加入，
2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞；
3.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述第一分化培养基进一步包括rock抑制剂；
4.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述第二分化培养基进一步包括vegf、bfgf、bmp4；
5.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述第三分化培养基进一步包括its-x、β-巯基乙醇、抗坏血酸、glutamax。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的培养基组合，其特征在于，
7.一种诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括第四分化培养基以及权利要求1-6中任一项所述的培养基组合中的第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基，
8.根据权利要求7所述的培养基组合，其特征在于，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞；
9.根据权利要求7所述的培养基组合，其特征在于，所述第四分化培养基进一步包括nad+、hla-c、sb203580、il-2中的至少之一；
10.权利要求1-6中任一项所述的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合、权利要求7-9中任一项所述的诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合在制备nk细胞中的用途。
11.一种制备cd34+造血干/祖细胞的方法，其特征在于，包括：
12.一种cd34+造血干/祖细胞，其特征在于，所述cd34+造血干/祖细胞通过权利要求11所述的方法获得。
13.一种制备nk细胞的方法，其特征在于，包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述um171的使用浓度为1nm-1μm，
15.一种nk细胞，其特征在于，所述nk细胞通过权利要求13或14所述的方法获得。
16.权利要求1-6中任一项所述的诱导多能干细胞分化为cd34+造血干/祖细胞的培养基组合、权利要求7-9中任一项所述的诱导多能干细胞分化为nk细胞的培养基组合、权利要求11所述的制备cd34+造血干/祖细胞的方法制备获得的cd34+造血干/祖细胞、权利要求12所述的cd34+造血干/祖细胞、权利要求13或14所述的制备nk细胞的方法制备获得的nk细胞、权利要求15所述的nk细胞在制备car-nk细胞中的用途。
17.一种car-nk细胞，其特征在于，所述car-nk细胞通过以下方法获得：对多能干细胞进行改造或基因编辑，获得具有表达car的多能干细胞，利用权利要求13或14所述的制备nk细胞的方法对所述car修饰的多能干细胞进行分化培养，获得car-nk细胞。
18.根据权利要求17所述的car-nk细胞，其特征在于，所述多能干细胞为ipsc细胞或商用胚胎干细胞。
19.一种细胞群，其特征在于，含有权利要求15所述的nk细胞和/或权利要求17、18所述的car-nk细胞。
20.一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于，包含权利要求15所述的nk细胞和/或权利要求17、18所述的car-nk细胞和/或权利要求19所述的细胞群。
技术总结
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种诱导多能干细胞分化为CD34<supgt;+</supgt;造血干/祖细胞的方法及其培养基组合。本发明提出诱导多能干细胞分化为CD34<supgt;+</supgt;造血干/祖细胞或NK细胞的方法及其培养基组合，利用本发明提供的培养方法获得的NK细胞纯度高，体外扩增效果好；iNK细胞产量高，单个iPSC可分化获得约2000个NK细胞；获得的iNK高表达CD16(超过70％)，解决了现有技术iNK CD16表达量低，需通过基因修饰方法解决CD16低表达的问题。
技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：深圳市三启生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23