Cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途

本发明涉及分子生物学，特别是涉及cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途。

背景技术：

1、成簇规则间隔短回文重复序列crispr(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，crispr)系统存在于90％的古菌基因组和40％的细菌基因组中，是细菌及古菌中针对噬菌体及外来核酸的适应性免疫系统，通过将cas蛋白靶向外来核酸序列实现切割，从而保护机体免受伤害。

2、cas12a(cpf1)是2类crispr-type v中的主要代表，与目前应用广泛的cas9相比有如下优势：(1)cas12a自身即带有rnase活性，可独立将pre-crrna加工为成熟的crrna；(2)效应蛋白靶向目的dna序列时，仅需要成熟的crrna作为引导序列，不需要借助tracr-rna；(3)具有ssdna反式切割活性。cas12a蛋白最近已经被用作可选的基因组编辑工具，作为一种在基因编辑中有用的分子剪刀或作为一种分子工具被应用于转录激活，但cas12a蛋白的更多用途尚有待开发。

3、目前活细胞基因组dna标记技术可以较好的实现对重复序列dna的有效标记，但其对基因组中非重复dna位点的标记能力欠佳，往往需要引入一段外源的序列才能实现标记。这些外源序列的引入，可能会对该序列两端的区域产生一系列未知的影响，如基因表达异常、表观遗传标记异常、染色质微环境失衡等。另一方面，这些手段往往具有较高的技术壁垒，操作繁复且耗时耗力，在实际应用中面临较大的桎梏。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途，用于解决现有技术中活细胞dna非重复位点标记困难的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供cas12a蛋白在荧光标记、成像或实时动态追踪中的用途。

3、优选地，所述cas12a的结构域rec相对于野生型cas12a的结构域rec为突变结构域；和/或，所述cas12a蛋白的d156、d235、e292或d350一个或多个的位点为氨基酸突变位点；和/或，所述氨基酸突变位点的突变为带负电的氨基酸突变为带正电的氨基酸；和/或，所述带正电的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

4、本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含前述用途中的cas12a蛋白、核定位信号和标记信号。

5、优选地，所述融和蛋白中第一核定位信号、cas12a蛋白、标记蛋白信号和第二核定位信号自n端到c端依次连接。

6、本发明还提供一种标记工具，所述标记工具包含前述融合蛋白和引导序列。

7、本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码前述标记工具的核苷酸序列。本发明还提供一种荧光标记的方法，所述为将前述标记工具或前述核酸构建体转入细胞用以标记dna。

8、本发明还提供前述标记工具或前述核酸构建体制备荧光标记产品或疾病诊断产品中的用途。

9、本发明还提供一种荧光标记产品或疾病诊断产品，所述荧光标记产品或疾病诊断产品中包含前述标记工具或前述核酸构建体。

10、如上所述，本发明的cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途，具有以下有益效果：

11、本发明主要利用crispr/dcas12a系统对pre-crrna的处理能力，在基因组重复区段或非重复区段设计针对该区域的pre-crrna array，从而简洁、经济、高效的实现对活细胞基因组重复区段或非重复区段的dna标记。本发明也筛选出了适合表达长pre-crrnaarray的cag启动子和直接重复序列，并利用本发明的cas12a蛋白和pre-crrna array，成功在非重复dna位点ccat1-l、myc、h3c1、gpbp1和hsph1实现了较高质量的dna标记。

技术特征：

1.cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述cas12a蛋白的结构域rec相对于野生型cas12a蛋白的结构域rec为突变结构域；和/或，所述cas12a蛋白包含1-4个氨基酸突变位点；和/或，所述氨基酸突变位点的突变为带负电的氨基酸突变为带正电的氨基酸；

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述cas12a蛋白包括：

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述荧光标记为dna标记或rna标记；和/或，所述荧光标记用于标记重复序列或非重复序列；和/或，所述荧光标记标记sat i、satii、sat iii、satα、satβ、ccat1-l、myc、gpbp1、hsph1或h3c1基因中的一种或多种；

5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含权利要求1-4任一所述的用途中的cas12a蛋白、核定位信号和标记信号。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含如下特征中的一项或多项：

7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述标记信号为荧光蛋白；优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白gfp、绿色荧光蛋白egfp、绿色荧光蛋白staygold、绿色荧光蛋白mneongreen、绿色荧光蛋白mclover3、蓝色荧光蛋白bfp、黄色荧光蛋白yfp、红色荧光蛋白dsred、红色荧光蛋白mplum、红色荧光蛋白mcherry、红色荧光蛋白mstrawberry、红色荧光蛋白morange、红色荧光蛋白mcitrine或红色荧光蛋白tdtomato中的一种或多种。

8.一种标记工具，其特征在于，所述标记工具包含权利要求5-7任一所述的融合蛋白和引导序列。

9.根据权利要求8所述的标记工具，其特征在于，所述引导序列中包含sgrna、crrna、tracrrna、pre-crrna或其对应的dna序列；

10.根据权利要求9所述的标记工具，其特征在于，所述直接重复序列包含如seq idno：7或seq id no：24任一所示的核苷酸序列；优选地，所述直接重复序列包含如seq idno：7或seq id no：24任一所示的核苷酸序列插入核酸适配体序列；更优选地，所述直接重复序列还包含在如seq id no：7或seq id no：24所示的核苷酸序列中插入核酸适配体序列，并且在所述核酸适配体序列的5’端插入1-2个核苷酸；更优选地，所述核酸适配体序列选自ms2核酸适配体序列或pp7核酸适配体序列。

11.根据权利要求10所述的标记工具，其特征在于，所述引导序列包含如seq id no：8-seqid no：17、seq id no：24-43任一所示的核苷酸序列。

12.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含编码权利要求8-11任一所述的标记工具的核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体还包含rnase抑制元件；优选地，所述rnase抑制元件选自snorna中的snord107、malat1中的triplex或黄病毒中的pseudo-knot中的一种或多种；

14.一种荧光标记的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求8-11任一所述的标记工具或权利要求12-13任一所述的核酸构建体转入体外活细胞用以标记dna。

15.权利要求8-11任一所述的标记工具或权利要求12-13任一所述的核酸构建体制备荧光标记产品或疾病诊断产品中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述荧光标记产品为同时标记1个或多个位点的荧光标记产品。

17.一种荧光标记产品或疾病诊断产品，其特征在于，所述荧光标记产品或疾病诊断产品中包含权利要求8-11任一所述的标记工具或权利要求12-13任一所述的核酸构建体。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及Cas12a蛋白在荧光标记、成像或基因实时动态追踪中的用途。本发明提供的用途能简洁、经济、高效的实现对活细胞基因组重复区段或非重复区段的DNA标记。本发明也筛选出了适合表达长pre‑crRNA array的CAG启动子和直接重复序列，并利用本发明的Cas12a蛋白和pre‑crRNA array，成功在非重复DNA位点CCAT1‑L、MYC、H3C1、GPBP1和HSPH1实现了较高质量的DNA标记。

技术研发人员：陈玲玲,敏逸晖,杨良中
受保护的技术使用者：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23