一种重组特立帕肽生物学活性测定方法与流程

本发明属于生物药物的生物学检测，具体而言，涉及一种重组特立帕肽生物学活性的测定方法。

背景技术：

1、重组特立帕肽[化学名称为重组人甲状旁腺素1-34，rhpth(1-34)]是由重组人甲状旁腺素n末端1-34氨基酸残基组成的多肽，通过基因重组技术将带有其编码基因的重组质粒转化到大肠杆菌，经过细胞培养、分离和纯化后获得。重组特立帕肽是一款促骨形成类抗骨松药物，可有效改善骨微结构、增加骨强度，同时能促进骨愈合，降低椎体和非椎体骨折风险，适用于有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症的治疗。

2、多肽类药物生物学活性的测定是药物有效性评价的重要指标，其在产品研发、生产工艺控制及质量控制方面必不可少。目前已报道的重组特立帕肽生物学活性的测定方法主要有放免法、化学发光法、细胞增殖法。以上几种检测方法操作较为繁琐，且需使用大型仪器进行检测，细胞增殖法还需严格控制细胞密度。本发明公开的方法为基于umr-106细胞的生物学活性测定方法，该方法准确、稳定可靠，精密度高，对细胞代次的改变均具有很好的耐用性，能够更好的满足于重组特立帕肽药物的工艺控制、放行检验等检验需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对目前现有重组特立帕肽生物学活性检测方法技术的不足之处进行优化研究，并进行方法学验证，提供一种准确度高、精密度好、耐用性强的重组特立帕肽生物学活性检测方法，不仅能够检测重组特立帕肽纯品，还能够适用于配方复杂的重组特立帕肽制剂，可以更好的应用于重组特立帕肽生物学活性检测。

2、为实现本发明的目的，提供一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，其包括以下步骤：

3、(1)取对数生长期生长状态良好的umr-106细胞，用培养基制备成1.0×

4、105～3.0×105cells/ml的细胞悬液，100μl/孔铺至细胞培养板，培养16～24h；

5、(2)倍比稀释重组特立帕肽参考品和供试品，所述重组特立帕肽参考品和供试品的起始浓度为0.5～0.7μg/ml，稀释倍数为3.5～5，共8～9个浓度梯度；

6、(3)将步骤(2)各浓度梯度的参考品和供试品分别以100μl/孔加入所述细胞培养板，与所述细胞孵育15～30min；

7、(4)孵育完成后，弃上清，用预冷的pbs清洗细胞；

8、(5)裂解细胞，检测camp含量，计算生物学活性。

9、在一些实施方案中，所述细胞悬液为2.0×105～3.0×105cells/ml，优选2.0×105cells/ml。在一些实施方案中，所述培养时间为20h。在一些优选实施方案中，所述细胞悬液为1.0×105～3.0×105cells/ml，所述培养时间为20h；或所述细胞悬液为2.0×105cells/ml，所述培养时间为16～24h。

10、在一些实施方案中，所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度；或所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为4，共8个浓度梯度；或所述起始浓度为0.7μg/ml，稀释倍数为5，共8个浓度梯度；所述起始浓度优选为0.5μg/ml，稀释倍数优选为3.5，优选共9个浓度梯度。

11、在一些实施方案中，所述裂解细胞包括以150μl/孔加入细胞裂解液，冻融一次。在一些实施方案中，所述细胞裂解液包含5mm tris，1％ sds，所述tris的ph为7.5。

12、在一些实施方案中，所述细胞的汇合度控制在80％～90％之间，优选约85％；所述培养基为完全培养基，包含deme培养基和10％胎牛血清。在一些实施方案中，所述细胞悬液的细胞活率≥90％。

13、在一些实施方案中，用样品稀释液倍比稀释所述重组特立帕肽参考品和供试品，所述样品稀释液包含磷酸盐缓冲液(pbs)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)，所述ibmx浓度为1mmol/l。ibmx是camp和cgmp磷酸二酯酶(pde)的一种非选择抑制剂，能够增强细胞内camp水平。选择pbs替代常规培养基作为稀释液，在维持检测效果的前提下能够进一步降低成本。

14、在一些实施方案中，所述孵育优选15min。所述培养或孵育条件包括37℃，5％co2。

15、在一些实施方案中，所述检测camp含量包括通过竞争elisa法检测camp含量。所述竞争elisa法检测camp含量包括在酶标板上包被camp抗体，加入细胞裂解物，再加入带辣根过氧化物酶hrp标记的camp，显色然后终止，测定450nm处的od值。

16、在一些实施方案中，所述计算生物学活性包括以参考品或供试品的稀释倍数为x轴，以对应的camp含量为y轴，拟合四参数方程曲线，计算半数稀释倍数(ec50)值，所述供试品的相对生物学活性＝供试品ec50/标准品ec50×100％。在一些实施方案中，所述camp含量以od450值表示。所述四参数方程曲线如下：

17、y＝a2+(a1-a2)/(1+(x/x0)^p)

18、x：供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数；

19、y：od值；

20、a1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；

21、a2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；

22、p：四参数曲线的斜率；

23、x0(ec50)：半效稀释倍数。

24、在一些实施方案中，所述供试品包括重组特立帕肽注射液，所述注射液包含重组特立帕肽原液、冰醋酸、无水醋酸钠、甘露醇、间甲酚、盐酸、氢氧化钠、注射用水。

25、在一些优选实施方案中，所述检测方法包括以下步骤：

26、(1)取对数生长期生长状态良好的umr-106细胞，用培养基制备成2.0×

27、105cells/ml的细胞悬液，100μl/孔铺至细胞培养板，培养20h；所述细胞的汇合度控制在约85％，所述细胞悬液的细胞活率≥90％；

28、(2)用样品稀释液倍比稀释重组特立帕肽参考品和供试品，所述重组特立帕肽参考品和供试品的起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度，所述样品稀释液包含pbs和1mmol/l的ibmx；

29、(3)将步骤(2)各浓度梯度的参考品和供试品分别以100μl/孔加入所述细胞培养板，与所述细胞孵育15min；

30、(4)孵育完成后，弃上清，用预冷的pbs清洗细胞；

31、(5)以150μl/孔加入细胞裂解液，先后放置于≤-70℃以及37℃冻融一次，所述细胞裂解液包含5mm tris，1％ sds，所述tris的ph为7.5，检测camp含量，以参考品或供试品的稀释倍数为x轴，以对应的camp含量为y轴，拟合四参数方程曲线，计算半数稀释倍数(ec50)值，所述供试品的相对生物学活性＝供试品ec50/标准品ec50×100％；所述四参数方程曲线如下：

32、y＝a2+(a1-a2)/(1+(x/x0)^p)

33、x：供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数；

34、y：od值；

35、a1：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最小值；

36、a2：x趋近于无穷大或无穷小时，y的最大值；

37、p：四参数曲线的斜率；

38、x0(ec50)：半效稀释倍数。

39、在另一方面，本发明提供了所述重组特立帕肽生物学活性的检测方法在重组特立帕肽药物生产工艺的质量控制中的应用。

40、本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

41、1、本发明提供了一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，通过优化细胞密度、裂解方式和样品稀释方式，提高了检测结果的准确度，具有良好的精密度和耐用性，各组样品相对偏倚(rb)、几何变异系数(gcv)均小于5％，活性理论值与测定值之间具有良好的线性关系，r2＝0.999，对细胞代次的容忍度高、培养时间灵活，在实际应用中更具便利性。

42、2、本发明提供了一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，能够实现复杂的重组特立帕肽制剂，尤其是重组特立帕肽注射液的准确检测，所述方法抗干扰能力强，在实际应用中具有更宽的适用范围。

技术特征：

1.一种重组特立帕肽生物学活性的检测方法，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述细胞悬液为2.0×105～3.0×105cells/ml，优选2.0×105cells/ml。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为3.5，共9个浓度梯度；或所述起始浓度为0.5μg/ml，稀释倍数为4，共8个浓度梯度；或所述起始浓度为0.7μg/ml，稀释倍数为5，共8个浓度梯度。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述裂解细胞包括以150μl/孔加入细胞裂解液，冻融一次；优选地，所述细胞裂解液包含5mm tris，1％sds，所述tris的ph为7.5。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述细胞的汇合度控制在80％～90％之间，所述细胞悬液的细胞活率≥90％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，用样品稀释液倍比稀释所述重组特立帕肽参考品和供试品，所述样品稀释液包含磷酸盐缓冲液(pbs)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)，所述ibmx浓度为1mmol/l。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述孵育为15min。

8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测camp含量包括通过竞争elisa法检测camp含量；优选地，所述竞争elisa法检测camp含量包括在酶标板上包被camp抗体，加入细胞裂解物，再加入带辣根过氧化物酶hrp标记的camp，显色然后终止，测定450nm处的od值。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述计算生物学活性包括以供试品、参考品的浓度对应的稀释倍数为x轴，以其对应的od值为y轴，拟合四参数方程曲线，计算半效稀释倍数(x0/ec50)；

10.权利要求1-9任一项所述重组特立帕肽生物学活性的检测方法在重组特立帕肽药物生产工艺的质量控制中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测重组特立帕肽生物学活性的方法。具体地，选用大鼠骨肉瘤(UMR‑106)细胞作为检测细胞，通过测定所述细胞在重组特立帕肽作用下的cAMP水平来反映其生物学活性。本发明建立的方法曲线拟合度高，准确度好，重复性高，耐用性强，能够很好的适用于重组特立帕肽生物学活性的检测。

技术研发人员：王敏,李艳,卢志新
受保护的技术使用者：信立泰（苏州）药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23