一种分离和或检测迁移体的方法与流程
本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种迁移体的分离和/或检测方法。
背景技术：
1、迁移体(migrasome)是一种细胞器。在细胞迁移过程中，胞体持续地向迁移体运输胞内物质。随后，收缩丝断裂，迁移体被释放，可在产生的局部或通过血液等体液运输到远端组织，继而被细胞外空间或周围的细胞所摄取。这表明迁移体可能参与胞内物质及信号在细胞之间的传递，从而介导细胞间通讯(ma l et.al.,discovery of the migrasome,anorganelle mediating release of cytoplasmic contents druing cell migration,cell res(2015)25:24-38)。
2、研究表明迁移体在胚胎发育、机体免疫应答、肿瘤、血管新生、组织再生等细胞迁移活跃的过程中发挥重要的信号传递作用。通过迁移体在斑马鱼胚胎发育中的研究发现，迁移体作为自然界信号分子的膜包被载体，决定信号分子的时空分布，从而发挥调控器官发育的功能(jiang d et.al.,migrasomes provide regional cues for organmorphogenesis during zebrafish gastrulation,nat cell biol,2019,21(8):966-977)。迁移体可以介导细胞间的蛋白和mrna传递，通过迁移体将蛋白和mrna转移到受体细胞，从而改变受体细胞的生命活动(zhu m et.al.,lateral transfer of mrna andprotein by migrasomes modifies the recipient cells,cell res,2020,doi；10.1038/s41422-020-00415-3)。迁移体可以通过将受损的线粒体清理出细胞，从而维持细胞内线粒体的稳态(jiao h et.al.,mitocytosis,a migrasome-mediated mitochondrial qualitycontrol process,cell,2021，184:2896-2910，doi:10.1016/j.cell.2021.04.027)。鸡胚发育过程中单核细胞产生的迁移体富集促血管新生的因子，调控血管新生(zhang cet.monocytes deposit migrasomes to promote embryonic angiogenesis；nat cellbiol,2022,24:1726–1738)。迁移体对肿瘤微环境中的癌细胞具有调控作用，如在胰腺癌细胞中迁移体可诱导抑制性免疫微环境从而促进肿瘤生长(张荣华，胰腺癌细胞迁移体对肿瘤微环境中癌细胞与相关免疫细胞表型及功能的相互调控作用研究，2020)。迁移体的这些功能，使得其极具研究和应用价值。本领域需要一种能够对迁移体进行分析的方法。
技术实现思路
1、本技术提供了一种分离和/或检测迁移体的方法，所述方法可以根据细胞外囊泡的特征实现迁移体的分离和/或检测。
2、本技术提供了一种能够实现对迁移体进行分离的方法。本技术提供了一种可以分离高特异性、高纯度的组织或疾病来源的迁移体的方法。本技术提供的分离迁移体的方法具有一种或多种下组所示的优势：操作简单、纯度高、回收率高、分散性高、保留完整性好、可以广泛普及。
3、本技术提供了一种能够实现检测迁移体的方法。本技术提供的检测迁移体的方法具有一种或多种下组所示的优势：操作简单、高灵敏度、高特异性、适用范围灵活广泛。
4、本技术提供了一种能够表征迁移体的方法，所述方法可以实现表征迁移体的来源细胞。
5、一方面，本技术提供了一种分离和/或检测迁移体的方法，所述方法包含通过细胞外囊泡的特征进行分离和/或检测。
6、在某些实施方式中，所述特征包含细胞外囊泡的成分特征。
7、在某些实施方式中，所述特征包含细胞外囊泡的成分是否存在和/或浓度。
8、在某些实施方式中，所述成分包含细胞外囊泡的标志物。
9、在某些实施方式中，所述标志物包含迁移体标志物。
10、在某些实施方式中，所述标志物包含蛋白质。
11、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于选自下组所示中的一种或多种：na+-k+atpase、myosin、ndst1、pigk、cpq、eogt、整合素(integrin，itg)和tetraspanin家族成员。
12、在某些实施方式中，所述tetraspanin家族成员包含且不限于tspan4，tspan7和tspan9。
13、在某些实施方式中，所述整合素包含但不限于itgav、itga5和/或itgb1。
14、在某些实施方式中，所述标志物包含脂质、多糖和/或核酸。
15、在某些实施方式中，所述标志物包含凝血因子。
16、在某些实施方式中，所述凝血因子包含且不限于因子viii,因子x,因子xiii,凝血酶原(prothrombin)，凝血酶(thrombin)。
17、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述迁移体标志物的存在。
18、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述迁移体标志物的浓度高于细胞和/或其他结构。
19、在某些实施方式中，所述标志物包含细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物。
20、在某些实施方式中，所述细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物选自下组所示中的一种或多种：钙结合蛋白(calnexin)，组蛋白(histone)，gm130，serca2，gapdh，lamp2，tsg 101，arf6和alix。
21、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述细胞结构物、其他细胞器和/或其他细胞外囊泡标志物的缺少或缺失。
22、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物的浓度低于细胞细胞、其他细胞器、其他细胞外囊泡和/或其他细胞结构。
23、优选的，所述其他细胞器包括外泌体、细胞内质网、细胞核、高尔基体、溶酶体等等。
24、在某些实施方式中，所述成分包含细胞外囊泡的整体组成成分。
25、在某些实施方式中，所述组成成分包含且不限于核酸、蛋白质、脂质和/或多糖。
26、在某些实施方式中，所述组成成分包含膜蛋白。
27、在某些实施方式中，所述膜蛋白包含且不限于整合素、马达蛋白、na-k atp酶，ndst1、pigk和/或tetraspanin家族成员。
28、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述膜蛋白的浓度高于细胞和/或其他结构。
29、在某些实施方式中，所述组成成分包含脂质。
30、在某些实施方式中，所述脂质包含且不限于胆固醇和/或鞘磷脂。
31、在某些实施方式中，所述特征包含样本中所述脂质的浓度高于细胞和/或其他结构。
32、在某些实施方式中，所述组成成分包含凝血因子。
33、在某些实施方式中，所述凝血因子包含且不限于因子viii,因子x,因子xiii,凝血酶原(prothrombin)，凝血酶(thrombin)。
34、在某些实施方式中，所述细胞外囊泡的特征包含结构特征。
35、在某些实施方式中，所述方法包含利用所述结构特征分离迁移体。
36、在某些实施方式中，所述结构特征包含膜包被的囊泡结构。
37、在某些实施方式中，所述膜来源于细胞膜。
38、在某些实施方式中，所述结构特征包含内部缺少部分或多数细胞结构。
39、在某些实施方式中，所述结构特征包含具有一个或多个腔内囊泡和/或细胞器。
40、在某些实施方式中，所述细胞器包含一个或多个线粒体和/或核糖体。
41、在某些实施方式中，所述结构特征包含部分囊泡有收缩丝相连或附着于收缩丝上。
42、在某些实施方式中，所述方法包含检测所述结构特征的存在。
43、在某些实施方式中，所述结构特征包含物理参数。
44、在某些实施方式中，所述方法包含根据物理参数使用的物理方法。
45、在某些实施方式中，所述结构特征包含大小特征。
46、在某些实施方式中，所述结构特征包含细胞外囊泡的颗粒大小为50-5000nm。
47、在某些实施方式中，所述方法包含检测细胞外囊泡的大小特征。
48、在某些实施方式中，所述检测方法包含但不限于：显微镜成像法、离心、过滤、超滤、透析、微流控分离、色谱法、流式细胞术。
49、在某些实施方式中，所述方法包含分离出颗粒大小为50-5000nm的细胞外囊泡。
50、在某些实施方式中，所述分离方法包含但不限于：显微镜成像法、色谱法、离心、过滤、超滤、透析、微流控分离、流式细胞术。
51、在某些实施方式中，所述结构特征包含密度特征。
52、在某些实施方式中，所述方法包含检测细胞外囊泡的密度。
53、在某些实施方式中，所述方法包含分离出符合迁移体密度特征的细胞外囊泡。
54、在某些实施方式中，所述分离方法包含但不限于：色谱法、离心、过滤、超滤、透析、微流控分离。
55、在某些实施方式中，所述方法包含4℃和/或22℃下的离心。
56、在某些实施方式中，所述方法包含以相同或不同的转速一次或多次离心。
57、在某些实施方式中，所述离心包含差速离心和/或密度梯度离心。
58、在某些实施方式中，所述方法包含以300xg-20000xg转速离心一次或多次。
59、在某些实施方式中，所述方法包含以300xg-20000xg转速离心5-120min。
60、在某些实施方式中，所述方法包含以10000xg-20000xg转速离心一次或多次。
61、在某些实施方式中，所述方法包含以10000xg-20000xg转速离心5-120min。
62、在某些实施方式中，所述方法包含以300xg-3000xg转速离心一次或多次。
63、在某些实施方式中，所述方法包含以300-3000xg转速离心2-10min。
64、在某些实施方式中，所述方法包含稀释步骤。
65、在某些实施方式中，所述方法包含以pbs溶液稀释待分离和/或检测的样本。
66、在某些实施方式中，所述待分离的样本为血液，所述方法包含以下步骤：(1)22℃下以800xg离心10-15min后收集上清；(2)22℃下以1000xg离心5min后收集上清；(3)以2-3倍体积的1×pbs溶液稀释；(4)4℃下以18000xg-20000xg离心40-60min后收集沉淀。
67、在某些实施方式中，所述待分离的样本包含且不限于骨髓，肺、肝、脾、淋巴结和肿瘤，所述方法包含以下步骤：(1)按需要以常规方法制备组织单细胞悬液，(2)300xg离心5min收集上清；(3)2000xg离心5min收集上清；(4)18000xg-20000xg离心40-60min收集沉淀。
68、在某些实施方式中，所述细胞外囊泡的特征包含功能特征。
69、在某些实施方式中，所述功能特征包含细胞外囊泡的产生可以被马达蛋白抑制剂抑制。
70、在某些实施方式中，所述马达蛋白包含且不限于myosin。
71、在某些实施方式中，所述马达蛋白抑制剂包含且不限于blebbistatin。
72、在某些实施方式中，所述功能特征包含可被wga染色。
73、在某些实施方式中，所述功能特征包含可附着于收缩丝上。
74、在某些实施方式中，所述功能特征包含可分泌小泡和/或分泌物质。
75、在某些实施方式中，所述分泌的物质包含且不限于细胞因子、趋化因子和/或生长因子。
76、在某些实施方式中，所述细胞因子包含且不限于il-6和/或tnfα。
77、在某些实施方式中，所述趋化因子包含且不限于cxcl12。
78、在某些实施方式中，所述生长因子包含且不限于vegf。
79、在某些实施方式中，所述功能特征包含可以被致炎因子诱导增加。
80、在某些实施方式中，所述致炎因子包含且不限于生物性因子、物理性因子、化学性因子、异物、组织坏死和/或免疫反应。
81、在某些实施方式中，所述致炎因子包含且不限于lps、细菌和/或创伤。
82、在某些实施方式中，所述功能特征包含表面可吸附凝血因子。
83、在某些实施方式中，所述凝血因子包含且不限于因子viii,因子x,因子xiii,凝血酶原(prothrombin)，凝血酶(thrombin)。
84、在某些实施方式中，所述标志物包含产生细胞外囊泡细胞的细胞标志物。
85、在某些实施方式中，所述特征包含细胞标志物是否存在和/或浓度。
86、在某些实施方式中，所述细胞标志物包含细胞类型标志物。
87、在某些实施方式中，所述细胞为白细胞。
88、在某些实施方式中，所述标志物为白细胞标志物。
89、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd45。
90、在某些实施方式中，所述特征为cd45阳性。
91、在某些实施方式中，所述细胞为髓系细胞。
92、在某些实施方式中，所述标志物为髓系细胞标志物。
93、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd11b。
94、在某些实施方式中，所述特征为cd11b阳性。
95、在某些实施方式中，所述细胞为中性粒细胞。
96、在某些实施方式中，所述标志物包含中性粒细胞标志物。
97、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于人的中性粒细胞标志物。
98、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd16和/或cd66b。
99、在某些实施方式中，所述特征为cd16阳性和/或cd66b阳性。
100、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于小鼠的中性粒细胞标志物。
101、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于ly-6g。
102、在某些实施方式中，所述特征为ly-6g阳性。
103、在某些实施方式中，所述细胞包含单核细胞。
104、在某些实施方式中，所述标志物包含单核细胞标志物。
105、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于人的单核细胞标志物。
106、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd14。
107、在某些实施方式中，所述特征为cd14阳性。
108、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于小鼠的单核细胞标志物。
109、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于ly-6c。
110、在某些实施方式中，所述特征为ly-6c阳性。
111、在某些实施方式中，所述细胞包含淋巴细胞。
112、在某些实施方式中，所述标志物包含淋巴细胞标志物。
113、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd45和cd11b。
114、在某些实施方式中，所述标志物为cd45和cd11b的组合。
115、在某些实施方式中，所述特征为cd45阳性且cd11b阴性。
116、在某些实施方式中，所述细胞包含t细胞。
117、在某些实施方式中，所述标志物包含t细胞标志物。
118、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd3，cd4，cd8和/或cd40l。在某些实施方式中，所述特征为cd3阳性和cd4阳性或cd3阳性和cd8阳性。
119、在某些实施方式中，所述细胞包含b细胞。
120、在某些实施方式中，所述标志物包含b细胞的标志物。
121、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于人的b细胞标志物。
122、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd19。
123、在某些实施方式中，所述特征为cd19阳性。
124、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于小鼠的b细胞标志物。
125、在某些实施方式中，所述细胞包含nk细胞。
126、在某些实施方式中，所述标志物包含nk细胞的标志物。
127、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于人的nk细胞标志物。
128、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd56。
129、在某些实施方式中，所述特征包含cd56阳性。
130、在某些实施方式中，所述标志物包含来源于小鼠的nk细胞标志物。
131、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于nk1.1。
132、在某些实施方式中，所述特征包含nk1.1阳性。
133、在某些实施方式中，所述细胞包含dc细胞。
134、在某些实施方式中，所述标志物包含dc细胞标志物。
135、在某些实施方式中，所述标志物包含且不限于cd11c。
136、在某些实施方式中，所述细胞包含肿瘤细胞。
137、在某些实施方式中，所述标志物包含肿瘤标志物。
138、在某些实施方式中，所述标志物包含但不限于epcam、her2和/或egfr。
139、在某些实施方式中，所述细胞包含肾小管上皮细胞。
140、在某些实施方式中，所述标志物包含肾小管上皮细胞标志物。
141、在某些实施方式中，所述标志物包含但不限于cd10、cd13。
142、在某些实施方式中，所述方法包含使用所述标志物的特异性结合剂。
143、在某些实施方式中，所述方法包含用结合迁移体标志物的结合剂、结合细胞结构标志物的结合剂、结合其他细胞器标志物的结合剂、结合其他细胞外囊泡标志物的结合剂和/或细胞标志物的结合剂与样本接触。
144、在某些实施方式中，所述能够特异性结合剂包含所述标志物的抗体或其抗原结合片段。
145、在某些实施方式中，所述抗原结合片段包含fab,f(ab)2,f(ab’),f(ab’)2,scfv,affibody和/或vhh。
146、在某些实施方式中，所述特异性结合剂包含可检测标记。
147、在某些实施方式中，所述检测所述标志物的存在和/或浓度包含检测被可检测标记修饰后的标志物的存在和/或浓度。
148、在某些实施方式中，所述可检测标记包含荧光标记、发光标记和/或非光学检测的标记。
149、本技术提供了一种分离和/或检测迁移体的方法，所述方法包含通过细胞外囊泡的多个特征的组合分离和/或检测迁移体。
150、在某些实施方式中，所述成分特征包含成分的是否存在和/或浓度。
151、在某些实施方式中，所述组合包含多个表面标志物特征。
152、在某些实施方式中，所述表面标志物特征包含标志物的是否存在和/或浓度。
153、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物特征和一个或多个细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物特征。
154、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构，与一个或多个细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物的缺失或缺少组合。
155、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物特征和一个或多个细胞标志物特征。
156、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构，与一个或多个细胞标志物的是否存在和/或浓度组合。
157、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构，与一个或多个细胞标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构组合。
158、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个迁移体标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构，与一个或多个细胞标志物的缺失或缺少组合。
159、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物特征和一个或多个细胞标志物特征。
160、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物的缺失或缺少，与一个或多个细胞标志物的存在和/或浓度高于细胞和/或其他结构组合。
161、在某些实施方式中，所述组合包含一个或多个表面标志物特征和一个或多个组成成分特征。
162、在某些实施方式中，所述组合包含结构特征的组合。
163、在某些实施方式中，所述组合包含多个结构特征。
164、在某些实施方式中，所述组合包含物理参数特征的组合。
165、在某些实施方式中，所述组合包含成分特征和结构特征的组合。
166、在某些实施方式中，所述组合包含物理参数特征和表面标志物特征的组合。
167、在某些实施方式中，所述组合包含颗粒大小和迁移体标志物特征的组合。
168、在某些实施方式中，所述组合包含颗粒大小和细胞标志物特征的组合。
169、在某些实施方式中，所述方法包含通过流式细胞仪分离和/或检测迁移体。
170、在某些实施方式中，所述组合包含密度特征和迁移体标志物特征的组合。
171、在某些实施方式中，所述组合包含密度特征和细胞标志物特征的组合。
172、在某些实施方式中，所述方法包含离心和细胞的标志物阴选和/或阳选。
173、在某些实施方式中，所述组合包含功能特征的组合。
174、在某些实施方式中，所述组合包含成分特征和功能特征的组合。
175、在某些实施方式中，所述组合包含结构特征和功能特征的组合。
176、在某些实施方式中，所述组合包含成分特征、结构特征和功能特征的组合。
177、在某些实施方式中，所述方法包含前处理样本的步骤。
178、在某些实施方式中，所述前处理包含使样本体积减小的步骤。
179、在某些实施方式中，所述前处理包含得到单细胞和/或单细胞群的步骤。
180、在某些实施方式中，所述前处理包含制备单细胞悬液。
181、在某些实施方式中，所述前处理包含且不限于使用物理方法和/或化学方法。
182、在某些实施方式中，所述物理方法包含且不限于剪切、消化和/或研磨。
183、在某些实施方式中，所述化学方法包含且不限于酶消化处理。
184、在某些实施方式中，所述酶包含且不限于胰蛋白酶、胶原酶和/或dna酶。
185、在某些实施方式中，所述方法包含提高迁移体纯度的步骤。
186、在某些实施方式中，所述方法包含去除迁移体以外的杂质。
187、在某些实施方式中，所述杂质包含细胞胞体、除迁移体以外的细胞器和/或除迁移体以外的细胞结构。
188、在某些实施方式中，所述方法包含且不限于离心、过滤、层析、微流控分离、阴性选择和/或阳性选择。
189、在某些实施方式中，所述样本为血液，所述杂质包含血小板。
190、在某些实施方式中，所述样本为血液，所述方法包含使用血小板结合剂去除血小板。
191、在某些实施方式中，所述血小板结合剂为cd41抗体。
192、在某些实施方式中，所述样本为肿瘤、骨髓、肝组织、肺组织、脾组织和/或淋巴结，所述方法包含以下步骤中的一种或多种：组织清理、剪切、消化、研磨，通过包含离心的方法去除细胞和组织碎片、通过离心和/或阴性或阳性选择获得迁移体。
193、在某些实施方式中，所述方法包含提高迁移体浓度或含量的步骤。
194、在某些实施方式中，所述方法包含将细胞外囊泡鉴定为迁移体的步骤。
195、在某些实施方式中，所述方法包含对迁移体定量的步骤。
196、在某些实施方式中，所述方法包含下组所示的一种或多种：使用共聚焦显微镜、使用电子显微镜、总蛋白量定量、免疫印记法、质谱分析、elisa、luminex或msd多种蛋白定量、流式细胞术、微流控分离、测序、和/或使用粒度分析仪。
197、在某些实施方式中，所述方法分离和/或检测的样本为体外样本。
198、在某些实施方式中，所述样本为细胞培养物。
199、在某些实施方式中，所述样本来源于受试者。
200、在某些实施方式中，所述样本为来源于体液。
201、在某些实施方式中，所述体液包含选自下组所示的一种：机体分泌液、血液、尿液、淋巴液、脑脊液、关节腔液和其他组织液。
202、在某些实施方式中，所述样本来源于实体组织或器官。
203、在某些实施方式中，所述样本为固体组织样本。
204、在某些实施方式中，所述组织或器官选自下组所示的一种或多种：骨髓、肿瘤、肝、肺、脾、淋巴结。
205、在某些实施方式中，所述样本为新鲜样本或标本。
206、在某些实施方式中，所述样本来源于哺乳动物。
207、在某些实施方式中，所述本来源于人或小鼠。
208、本技术提供了一种分离和/或检测特定细胞产生的迁移体的方法，其包含：(a)筛选出特定细胞；和(b)分离和/或检测其细胞外囊泡。
209、在某些实施方式中，所述筛选特定细胞包含通过细胞功能特征进行筛选。
210、在某些实施方式中，所述细胞功能特征包含分泌细胞因子。
211、在某些实施方式中，所述细胞因子包含tnfα和/或il-6。
212、在某些实施方式中，所述筛选特定细胞包含通过细胞标志物进行筛选。
213、在某些实施方式中，所述方法包含检测迁移体产生细胞的标志物的存在和/或浓度。
214、在某些实施方式中，提供一种分离/检测目的细胞迁移体的方法，包括(1)对待分离的样本进行前处理；(2)根据目的细胞的标志物分离目的细胞迁移体；(3)根据迁移体的标志物或者迁移体染色分离目的细胞迁移体。
215、优选的，所述目的细胞包括中性粒细胞、单核细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和/或肾小管上皮细胞。
216、中性粒细胞的标志物包括cd66b、cd16、mpo或者ly-6g；
217、单核细胞的标志物包括cd14、ccr2；
218、t细胞的标志物包括cd4、cd8；
219、b细胞的标志物包括cd19；
220、nk细胞的标志物包括cd56、nk1.1；
221、肿瘤细胞的标志物包括epcam、her2和/或egfr；
222、免疫细胞的标志物包括cd45；
223、肾小管上皮细胞的标记物包括cd10、cd13；
224、血小板的标志物包括cd41。
225、迁移体的标志物包括整合素(例如itga5)、cpq、eogt、pigk。
226、优选的，所述待分离的样本包括血液、淋巴组织、肺组织、肿瘤组织、尿液；所述样本来源于人或小鼠。
227、优选的，所述方法还包括在步骤(1)后(1-1)去除非目的细胞的步骤。
228、更优选的，所述分离/检测目的细胞迁移体的方法还包括(4)根据其他细胞器和/或其他细胞外囊泡的标志物分离目的细胞迁移体，所述其他细胞器的标记物阴性或者表达下降，进一步优选的，所述其他细胞器包括外泌体、细胞内质网、细胞核、高尔基体、溶酶体等等。
229、进一步优选，所述其他细胞器的标志物包括：
230、外泌体的标志物包括tsg101，alix；
231、内质网的标志物包括calnexin，serca2；
232、细胞核的标志物包括组蛋白3；
233、高尔基体的标志物包括gm130；
234、其他细胞外囊泡标志物包括arf6；
235、所述分离步骤包括以标志物的结合剂(例如抗体)进行分离。
236、本技术提供了一种迁移体，所述迁移体由本技术所述的方法分离和/或检测而得。
237、本技术提供了一种迁移体，所述迁移体来源于体液。
238、在某些实施方式中，所述体液包含且不限于机体分泌液、血液、尿液、淋巴液、脑脊液、关节腔液和其他组织液。
239、本技术提供了一种迁移体，所述迁移体来源于包含且不限于骨髓、肝、肺、脾、淋巴结或肿瘤等实体组织或器官。
240、本技术提供了一种组合物，其包含所述的迁移体。
241、本技术提供了一种标志物在分离和/或检测迁移体中的应用。
242、在某些实施方式中，所述标志物包含迁移体标志物、细胞结构标志物、其他细胞器标志物、其他细胞外囊泡标志物和/或细胞标志物。
243、本技术提供了一种试剂，所述试剂包含标志物结合剂。
244、在某些实施方式中，所述标志物包含迁移体标志物、细胞结构标志物、其他细胞器标志物、其他细胞外囊泡标志物和/或细胞标志物。
245、在某些实施方式中，所述试剂用于分离和/或检测迁移体。
246、在某些实施方式中，所述标志物结合剂包含：
247、(1)所述标志物的抗体或其抗原结合片段，优选的，所述抗原结合片段包含fab,f(ab)2,f(ab’),f(ab’)2,scfv,affibody和/或vhh；
248、(2)可检测标记，优选的，所述可检测标记包含荧光标记、发光标记和/或非光学检测的标记。
249、优选的，所述细胞标志物包括中性粒细胞、单核细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和/或肾小管上皮细胞标志物。
250、更优选的，
251、中性粒细胞的标志物包括cd66b、cd16、mpo或者ly-6g；
252、单核细胞的标志物包括cd14、ccr2；
253、t细胞的标志物包括cd4、cd8；
254、b细胞的标志物包括cd19；
255、nk细胞的标志物包括cd56、nk1.1；
256、肿瘤细胞的标志物包括epcam、her2和/或egfr；
257、免疫细胞的标志物包括cd45；
258、肾小管上皮细胞的标记物包括cd10、cd13；
259、血小板的标志物包括cd41；
260、迁移体的标志物包括整合素(例如itga5)、cpq、eogt、pigk。
261、优选的，所述其他细胞器包括外泌体、细胞内质网、细胞核、高尔基体、溶酶体等等；
262、更优选，所述其他细胞器的标志物包括：
263、外泌体的标志物包括tsg101，alix；
264、内质网的标志物包括calnexin，serca2；
265、细胞核的标志物包括组蛋白3；
266、高尔基体的标志物包括gm130。
267、其他细胞外囊泡标志物包括arf6。
268、本技术提供了一种试剂在分离和/或检测迁移体中的用途，所述试剂包含本技术所述的试剂。
269、本技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本技术所述的试剂。
270、本技术提供了所述的方法，所述的迁移体，所述的组合物、所述的试剂和/或所述的试剂盒在制备诊断疾病试剂盒中的用途。
271、本技术提供了所述的方法，所述的迁移体和/或所述的组合物、所述的试剂和/或所述的试剂盒在制备治疗疾病药物中的用途。
272、本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
技术特征：
1.一种分离和/或检测迁移体的方法，其特征在于，所述方法包含通过细胞外囊泡的特征进行分离和/或检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的特征包含细胞外囊泡的成分特征，优选的，所述细胞外囊泡的特征包含细胞外囊泡的成分是否存在和/或浓度，更优选的，所述成分包含细胞外囊泡的标志物，进一步优选的，所述标志物包含迁移体标志物，
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述特征包含样本中所述迁移体标志物的存在，优选的，所述特征包含样本中所述迁移体标志物的浓度高于细胞和/或其他结构。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述标志物包含细胞结构标志物、其他细胞器标志物和/或其他细胞外囊泡标志物，
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述成分包含细胞外囊泡的整体组成成分，
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的特征包含结构特征，优选的，所述方法包含利用所述结构特征分离迁移体，
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述迁移体来源于待分离的样本，所述待分离的样本包含且不限于体液、实体组织或器官，
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的特征包含功能特征，
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡细胞的特征包含产生细胞外囊泡细胞的细胞标志物特征，
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含使用所述标志物的特异性结合剂，
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含通过细胞外囊泡的多个特征的组合分离和/或检测迁移体，
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包含通过多个标志物特征的组合分离和/或检测迁移体，
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述方法还包含通过一个或多个标志物特征和一个或多个组成成分特征的组合分离和/或检测迁移体。
14.根据权利要求11-13任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含通过下列任一项的组合分离和/或检测迁移体：
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含前处理样本的步骤。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含提高迁移体纯度的步骤。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含且不限于离心、过滤、层析、微流控分选和/或分离、阴性选择、阳性选择，共聚焦显微镜、使用电子显微镜、总蛋白量定量、免疫印记法、质谱分析、elisa、luminex或meso scale discovery(msd)多种蛋白定量、流式细胞术、微流控分选和/或分离、测序和/或使用粒度分析仪。
18.一种分离和/或检测特定细胞产生的迁移体的方法，其特征在于，其包含：(a)筛选出特定细胞；和(b)分离和/或检测其细胞外囊泡。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述筛选特定细胞的步骤包含：
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)分离和/或检测其细胞外囊泡包括利用权利要求1-17中任一项所述的方法分离和/或检测其细胞外囊泡。
21.一种表征迁移体来源的方法，其特征在于，所述方法包含利用权利要求1-20中任一项所述的方法检测迁移体产生细胞的标志物的存在和/或浓度。
22.一种分离的迁移体，其特征在于，所述迁移体由权利要求1-20中任一项所述的方法分离和/或检测而得。
23.根据权利要求22所述的分离的迁移体，其特征在于，所述迁移体来源于体液、实体组织或器官，
24.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求22-23中任一项所述的迁移体。
25.一种标志物在分离和/或检测迁移体中的应用，其特征在于，所述标志物包含迁移体标志物、细胞结构标志物、其他细胞器标志物、其他细胞外囊泡标志物和/或细胞标志物，优选的，所述标志物如权利要求1-21任一项方法中所限定。
26.一种试剂，其特征在于，所述试剂包含标志物结合剂，所述标志物包含迁移体标志物、细胞结构标志物、其他细胞器标志物、其他细胞外囊泡标志物和/或细胞标志物。
27.根据权利要求26所述的试剂，其特征在于，所述标志物结合剂包含：
28.一种试剂在分离和/或检测迁移体中的用途，其特征在于，所述试剂包含权利要求26-27中任一项所述的试剂。
29.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求26-27中任一项所述的试剂。
30.权利要求1-21中任一项所述的方法，权利要求22-23中任一项所述的迁移体，权利要求24中所述的组合物、权利要求26-27中任一项所述的试剂和/或权利要求29中所述的试剂盒在制备诊断疾病试剂盒和/或治疗疾病药物中的用途。
技术总结
本申请涉及一种分离和/或检测迁移体的方法，所述方法包括利用细胞外囊泡的特征进行分离。
技术研发人员：俞立,姜东,王懿峥,杜万清,贾皓昊,谢任翔,杨玉清,费丹霞,戴宸,周禾,侯信锋,冉雷莉
受保护的技术使用者：北京迈格松生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23